皮质骨I型胶原的提取及胶原明胶支架材料的制备

1、皮质骨I型胶原的提取及胶原-明胶支架材料的制备【关键词】组织工程胶原提取神经支架Keyrds：tissueengineering;llagen;extratin;nervesaffld周围神经缺损后的修复再生和功能恢复一直是神经科学领域的难点和热点。由于周围神经构造和功能上的特殊性，损伤后大多数情况下无法直接对拉吻合，自体神经移植又有诸多限制，因此寻找一种神经替代物来修复缺损是非常必要的。近年来，随着组织工程技术的开展，用于神经修复研究的材料品种越来越多。目前型胶原蛋白制品为组织工程修复神经研究中应用较多的生物材料之一1。型胶原通常来自牛腱、鼠尾或皮肤，由于上述组织中含有大量其它种类的胶原和非

2、胶原成分，提取及纯化工艺复杂。骨中型胶原含量丰富，占骨基质中有机成分的95以上，本实验将传统的酶提取法加以改良，提取牛皮质骨中I型胶原并制备神经支架材料。1材料与方法1.1骨基质粉的制备取新颖牛长骨，去除软组织、骨膜、骨端松质骨及骨髓，然后将皮质骨劈成骨块，乙醇(60、70、80、90)梯度脱水，液氮冷冻后放入高速组织粉碎机中，粉碎为直径0.62骨粉，持续搅拌下参加甲醇：氯仿(11，vv)脱脂48h，每24h换脱脂液1次;0.6lL盐酸脱钙84h，分别于第12、36、60h换脱钙液，脱钙完毕后去离子水洗涤3次备用。1.2胶原的提取将50g牛皮质骨基质粉浸在500l0.05lL冰醋酸和500g胃

3、蛋白酶混合溶液中，持续搅拌96h。待混合物变为无色、透明、粘稠液体后高速低温离心20in(10000rin)，以去除未溶解杂质。其上清即为液态粗制胶原。在上清中缓慢参加Nal，搅拌过夜，离心20in(15000rin)，去上清，沉淀物参加0.5lL冰醋酸溶解，离心20in(15000rin)，取上清参加5lLNaH调pH至7.3，缓慢参加Nal，搅拌过夜，离心20in(15000r/in)，去上清，沉淀物参加0.5lL醋酸中透析溶解，离心10in(15000r/in)，去沉淀，上清装入透析袋中持续透析72h，每4h更换透析液1次。最终收获无色透明粘性液体，浓缩冻干。以上液体及操作在47进展。1

4、.3支架材料的制备称取样品150g、明胶(Siga公司)75g溶于0.05lL冰醋酸溶液，4条件下搅拌90in(18000rin)，负压抽真空后于4冰箱中过夜，充分混合成凝胶状悬浊液后将其注入长10、内径3的硅胶管中，密封两端，顺轴向以自制微型调速仪以210-5s的速度浸入冷凝剂中，将悬浊液-硅胶管冷冻物放入预冷的铝盘中，于-40、100Trr条件中冻干48h，制得枯燥成形的胶原蛋白支架材料2。材料用戊二醛交联，60消毒密封备用3。1.4胶原的鉴定1.4.2将冻干样品水解后，应用Bekan121B型氨基酸自动分析仪进展氨基酸分析。1.5支架材料内部扫描电镜观察以扫描电镜观察上述制备的胶原蛋白支

5、架材料横截面和纵切面并测量材料内部微孔的直径。2结果2.1选择适当时间点换脱钙液，持续脱钙84h，可将骨粉中的钙离子含量降到较低程度(图1)。2.2胶原样品鉴定结果2.2.1提取的样品冻干后呈蓬松的白色海绵状，具有吸潮性图2。2.2.3最大光吸收波长检验结果样品在230n波长处显示较强的光吸收，符合胶原特性。2.2.4样品氨基酸分析结果甘氨酸占氨基酸总量的31.12%，羟脯氨酸占氨基酸总量的9.12%，脯氨酸占氨基酸总量的12.85%，羟脯氨酸与脯氨酸之比约0.71，氨基酸构成比符合型胶原特性表1。表1皮质骨磁针原氨基酸组成2.3扫描电镜观察结果支架材料外观为外表封闭的圆柱状构造，电镜下见纵切

6、面为轴向平行排列的微管构造，横切面上微管构造呈内径均一的蜂巢状分布，孔径在20100，接近于坐骨神经构造图4、5。3讨论近年来，应用组织工程技术构建种子细胞和具有良好生物相容性的支架材料复合体人工神经修复外周神经损伤成为研究的重点。人工神经研究的关键之一在于如何选择适宜的支架材料，以便复合种子细胞、神经营养因子从而更好的发挥促神经再生作用。目前，以天然的细胞外基质为原料制备支架材料成了研究的新方向。胶原是细胞外基质的主要成分，广泛分布于骨、肌腱、韧带、皮肤、软骨等结缔组织中，约占动物体内蛋白质总量的1413，在细胞的分化、运动化趋向、结缔组织修复等方面发挥重要作用，同时具有生物可降解性、低抗原

7、性、低毒性、能诱导细胞再生及易获得性等诸多优点，可参与组织愈合过程，在软骨细胞再生诱导4、角膜移植5、人工皮肤制备6等方面得到广泛应用，应用在周围神经损伤修复中亦能刺激改善神经的再生7。图1钙离子浓度变化图2冻干样品图3样品电泳图谱图4扫描电镜下观察支架材料横切面400图5扫描电镜下观察支架材料纵切面200以往胶原的提取多集中在相对易于处理的牛腱、猪皮和鼠尾腱。由于胶原是一个大的蛋白家族，从上述组织中提取时分型、纯化难度较大，程序复杂，而且耗时较长，易导致胶原变性。骨胶原的提取纯化报道较少，而骨中有机质90以上为胶原，主要为I型胶原，有望作为制备I型胶原的重要来源。作者将传统的酶溶解法加以改良

8、应用于骨胶原的提取，在骨粉颗粒直径、脱脂脱钙时间、酶促溶解、抽提次数等方面加以细化，省去分型、纯化等冗长程序，耗时较短，经济简便。I型胶原的氨基酸组成中，甘氨酸约占氨基酸总量的13;含有羟赖氨酸和羟脯氨酸，一般蛋白质中那么不存在羟赖氨酸，羟脯氨酸也很少见;羟脯氨酸与脯氨酸之比约为0.70.8。本实验样品胶原氨基酸分析符合I型胶原的组成特征，最大光吸收波长在230n附近，电泳分析其区带与I型胶原标准品区带一样。结果显示，作者通过实验获得了纯度较高的I型胶原。作者以实验获得的I型胶原和明胶为主要原料，构建了具有微管排列构造的支架材料，其内径在20100，三维构造上接近于坐骨神经，具有一定的仿生效果。实验说明8，