rRNA基因内转录间隔区作为遗传标记的应用现状及前景

1、rRNA基因内转录间隔区作为遗传标记的应用现状及前景【摘要】随着分子生物学技术的不断开展，rRNA基因内转录间隔区ITS作为一种遗传标记，已经被广泛应用于微生物菌种分类与鉴定、中药材鉴定和品质评价、植物种质资源鉴定、动物种系发生、遗传多样性与亲缘关系、病原诊断、系统发育研究等不同方面的研究。文章就近年来rRNA基因内转录间隔区的应用现状及前景进展综述。【关键词】rRNA基因内转录间隔区遗传标记遗传标记是指可追踪染色体、染色体某一节段或某个基因座在家系中传递的任何一种遗传特性，具有可遗传性和可识别性1。生物中任何有差异表型的基因突变型均可作为遗传标记。rRNA基因又称为rDNA，它是编码rRNA

2、核糖体RNA的基因，由rDNA及其相邻的间隔区组成。在真核生物中，rRNA基因内转录间隔区是rDNA上的一个非编码区域，它包括ITS-1位于18SrDNA和5.8SrDNA之间和ITS-2位于5.8SrDNA和28SrDNA之间区。该区域受外界环境的影响较小，与编码区相比具有进化速度快的特点2，3。而原核生物的ITS序列是16S-23SrDNA内转录间隔序列，它在原核生物中普遍存在，在环境条件改变时相对稳定3。高等植物中的rDNA是高度重复的串联序列单位，它的ITS序列是18SrDNA-5.8SrDNA-26SrDNA间隔区序列，所受的选择压力小，进化速率较快，在物种间表现出较高的差异。因此，

3、真核生物细胞基因组中rDNA间隔区18SrDNA-5.8SrDNA-26SrDNA序列可以作为一种遗传标记。近年来，rDNAITS已成为重要的分子标记之一，在微生物、动物、植物等各个方面有着广泛的应用。1rRNA基因内转录间隔区在微生物菌种分类及鉴定中的应用原核生物细胞16S-23SrDNA间隔区具有普遍性和高变性，由于不同菌种16S-23SrDNA间隔区所含tRNA的数目、类型不同，具有长度和序列上的多态性，用于菌种分类鉴定具有优越性。因此，可作为菌种分类及鉴定的一种新方法。张灵霞等4分别用通用引物a和结核分枝杆菌特异引物b扩增分枝杆菌复合菌群的16S-23SrDNA间隔区序列，扩增产物经R

4、FLP分析，结果显示应用引物a能将除结核分枝杆菌复合菌群外的其它受试菌群中的各菌群分开，而引物b可将结核分枝杆菌与结核分枝杆菌复合菌群中的其它菌分开，从而到达菌种鉴定的目的，为结核病的早期诊断和鉴别诊断提供根据。温博贵等5研究发现，rRNA基因间隔区扩增后测序是一种准确、重复性好的鉴定牙龈卟啉菌的分子遗传学方法。LI等6对产氢菌的16S-23SrDNA间隔区进展PR扩增，发现该间隔区碱基序列存在长度多态现象，利用这一现象可识别和识别产氢发酵细菌。传统的真菌分类主要从菌株的形态特征、生长特性、生理生化指标等方面进展，ITS序列标记的出现使得真菌分类鉴定研究进步到一个新的程度。真菌的ITS多态性大

5、都表现为属内种间差异明显，而种内较为一致的规律性。杨红等7对尖孢镰刀菌异核体及其同核型别离子菌株的ITS区进展测序分析，结果说明其碱基组成完全一样，属内种间的同源性在34%99%之间，种内同源性在98%以上。ITS区不合适尖孢镰刀菌种内或种以下程度的分类鉴定。张传博等8用rDNAITS区的PR-RFLP技术对9个植物病原真菌与灭蚊真菌进展了快速成功地鉴别，证明了所别离的植物病原真菌主要是瓜果腐霉，与灭蚊腐霉有明显区别。Glushakva等9对11个植物种酵母别离株进展鉴定，根据其生理特性和5.8S-ITSrDNA限制性酶切片断将其鉴定为奇异酵母。王桂文等10用真菌通用引物对18个红菇子实体样本

6、及3个组织别离株的rRNA基因内转录间隔区进展PR扩增，以鉴别红菇组织别离株的真伪。结果发现别离株的ITS序列全长明显小于实体样本的ITS序列全长，与红菇属真菌的遗传间隔 大，均不是红菇的别离株。骆志成等11在国内首次对烟曲霉rRNA基因内转录间隔区进展克隆测序分析，结果显示，烟曲霉rRNA基因的ITS、区均非常保守。与黄曲霉、黑曲霉、土曲霉等比拟，均有一定程度的差异，这说明其种间ITS区序列变异大于种内变异。王强等12对16株皮肤癣菌ITS序列进展分析，11株菌与形态学结果一致，1株鉴定为金孢子菌，另外4株不能确定。此结果说明ITS序列分析法可用于菌种鉴定，但有局限性，应与形态学鉴定互相补充

7、。窦红涛13将rDNAITS序列分析用于快速鉴定临床常见的镰刀菌。由此可见，rRNA基因ITS序列分析在临床疾病的诊断和鉴别诊断中应用广泛。2rRNA基因内转录间隔区应用于植物类中药材鉴定和品质评价由于近年来毁林、毁草开荒，自然生态被严重破坏，野生中药材日渐稀少，而人工栽培的中药资源越来越多。在中药材市场上，以次充好、以假乱真的现象严重。因此，如何对中药材进展有效地鉴定和品质评价成为首要待解决的问题。中药材鉴别所根据的遗传标记已从传统的形态标记、生化标记包括免疫学标记、组织细胞标记开展到了分子标记，rRNA基因内转录间隔区序列分析技术已越来越多地应用于植物性中药材的品质鉴定中。徐红等14通过对

8、14个黄草石斛类群和1个混淆品石仙桃的rDNAITS序列分析说明，ITS1和ITS2序列信息位点丰富，不同种的石斛各类群均有多个特异性的核苷酸变异位点，与外类群的变异最大，可用于鉴定每一种石斛药材及其混淆品；石斛种间各类群碱基差异百分率高，但显著低于与混淆品间的差异百分率，说明这两段序列在种内保守、种间分化活泼，属间差异较大，可作为中药黄草石斛的分子鉴定标记。王淑美等15用特异性PR技术对16个牛膝样品的rDNAITS区碱基序列进展扩增测序，结果说明，ITS-1约为230bp，ITS-2约为209bp。牛膝与川牛膝、土牛膝的碱基序列有明显差异，可用于牛膝种间及真伪品的鉴别。沈洁等16对7个不同

9、居群的花椒及3个混淆种的rDNAITS区进展碱基测序发现，花椒与其混淆种的ITS区序列差异非常显著，有71个变异位点，4个特异性识别位点。在花椒各居群中那么有15个变异位点、12个信息位点、3个特异性识别位点。根据这个特征可准确鉴别各居群的花椒及其混淆品。丁平17、刘忠权等18将rDNA-ITS序列分析分别用于巴戟天及其常见混伪品、白花蛇舌草与其混淆品的鉴定中亦行之有效。rRNA基因内转录间隔区不仅用于鉴定植物性中药材与其混淆品，还可用于中药材与其近缘种以及道地药材的鉴别。曾明等19对中药葛根及其近缘种的rDNA-ITS进展序列分析，结果显示，ITS区序列在种内的差异很小，野葛与粉葛在ITS1

10、、ITS2区的差异性分别在2.10%和2.09%以内，而山葛与野葛、粉葛的差异性那么在8.14%和12.82%以上，说明rDNA-ITS序列是鉴别近缘种的理想分子指标。高小霞等20研究说明，利用rDNAITS-RFLP法可快速区分佛手及其近缘种香橼。余永邦等21对14个产区的太子参进展ITS扩增及测序，其中4个产区的ITS碱基序列完全一致，另外10个产区的ITS序列有不同的变异，可用于鉴别不同产区的太子参。王东等22分析发现怀山药与其它产地山药的rDNA-ITS区序列有着不同的变异，可把地道产区的山药怀山药ITS序列作为标准，用以鉴别不同产地的山药。ang等23对不同来源的忍冬进展PR-RFL

11、P分析，扩增产物中道地忍冬超过70%，而非道地忍冬缺乏20%。此方法可用于鉴定道地忍冬。3rRNA基因内转录间隔区应用于物种亲缘关系及系统发育关系研究rRNA基因内转录间隔区在不同物种亲缘关系及系统发育关系方面的研究应用广泛。卢明锋等24采用真菌通用引物克隆了一株产苝醌衍生物真菌的rDNA-ITS区段，经序列比对说明该菌株与竹黄属的亲缘关系较近，ITS序列相似度到达92%。王晓英等25对4株AT典型菌株和12株中国不同省区产毒串珠镰刀菌rDNA间区进展序列测定分析，结果显示，中国rDNAITS2序列型的串珠镰刀菌与南非别离菌株AT52539一致。中国胶孢镰刀菌别离株SD197-Fv047和SD

12、207-Fv049的序列与尖孢镰刀菌高度同源。此结果有助于进一步研究水稻枯萎病赤霉群的系统发育关系。王超等26测定了山羊草属二倍体物种核rDNA-ITS区序列，对其进展聚类分析结果显示，Ae.speltides与该组其他种相距很远，可从Sitpsis组中独立出来；Ae.uniaristata与不同组的Ae.audata和Ae.ubellulata关系很近。Stranzinger等27对茜草科进展种系发育关系研究，分析了其rDNA-ITS序列，16个种分为3大分支。喻达辉等28利用rDNA-ITS序列对珠母贝属常见种类的系统发育和分类地位进展了分析，所研究的种类聚合成3个大类群。类群I中,我国的

13、P.fuata，日本的P.fuataartensii和澳大利亚的P.ibriata可能为同种,类群II中P.albina和P.nigra可能是两个亚种。rRNA基因内转录间隔区除了上述3个主要方面的应用，还能应用于其他方面。郭琼霞等29通过对假高粱及其同属近似种的rDNA-ITS区进展扩增和RFLP分析，可将假高粱与明福1号、拟高粱区分开来。王国芬等30研究证实斐济球腔菌是目前引起海南省香蕉叶斑病的主要病原菌，并设计了专门检测鉴定该菌的特异性引物，用于香蕉褐缘灰斑病的分子鉴定及辅助检测。4rRNA基因内转录间隔区作为遗传标记的应用前景rRNA基因内转录间隔区作为一种遗传分子标记，与形态标记、细

14、胞学标记和生化标记相比，具有明显的优越性。详细表现为：该区域受外界环境影响较小，所受选择压力小，进化速度快，在物种间表现出极为广泛的序列多态性；rDNA-ITS核苷酸序列长度适中，含足够量的遗传信息；rDNA的ITS区在核基因组内是中等重复的，并且这种重复序列高度相似或一致化，为PR产物直接测序提供了可能；能根据保守序列中的变异位点设计特殊引物进展扩增比拟；此技术快速、灵敏、准确。这些优点奠定了rRNA基因内转录间隔区具有广泛应用性的基矗rRNA基因内转录间隔区在菌种分类鉴定、植物性中药材鉴定、物种亲缘关系及系统发育关系研究、动物种系发生、植物种质资源鉴定等方面的应用已获得重要成果。相信随着现

15、代分子生物学技术日新月异地开展，rRNA基因内转录间隔区将具有更为广阔的应用前景。【参考文献】1周延清.DNA分子标记技术在植物研究中的应用，第1版.北京：化学工业出版社，2022：1.2林剑伟，阙友雄，陈天生，等核糖体DNA的内转录间隔区序列标记在真菌分类鉴定中的应用J.生物技术通讯，2022，182：292.3王梦芝，王洪荣，陈明，等rDNA分子生物学技术及其在瘤胃微生物应用的研究进展J.草食家畜季刊，2022，134：1.4张灵霞，庄玉辉16S23SrDNA间隔区序列PR和RFLP分析对分枝杆菌复合菌群鉴定的研究J.中华微生物和免疫学杂志，2000，204：312.5LIYng-feng

16、,ZHENGGu-xiang,ZHANGen-qi,etal.Sequenelengthvariatinfinternalgenispaef16SrDNA-23SrDNAinbihydrgen-bateriuJ.JurnalfHarbinUniversityfere(NaturalSienesEditin),2022,21(3):279.6彭桂香，陈文新，谭志远rRNA基因间隔区序列用于亲缘关系亲密的根瘤菌种群鉴定及系统发育分析J.华南农业大学学报，2022，254：58.7杨红，李颖，关国华，等尖孢镰刀菌异核体及其不同核型别离子rDNAITS区序列分析J.农业生物技术学报，2002，104：

17、381.8张传博，苏晓庆rDNAITS区间PR-RFLP在腐霉属11菌株快速鉴别中的应用J.贵阳医学院学报，2022，306：479.9GlushakvaA,IvannikvaIuV,NauvaES,etal.assiveislatinandidentifiatinfSaharyesparadxusyeastsfrplantphyllsphereJ.ikrbilgiia,2022,76(2):236.10王桂文，孙文波广西红菇子实体及别离株的rDNAITS序列分析J.广西科学，2022，113：261.11骆志成，王瑞礼，李假设瑜，等烟曲霉rRNA基因ITS区的克隆测序分析J.菌物系统，200

18、0，193：336.12王强，冀朝辉，李厚敏，等常见皮肤癣菌18S28SrDNAITS序列同源性分析J.中华微生物学和免疫学杂志，2022，264：365.13窦红涛，李假设瑜，万哲，等.临床常见镰刀菌rDNAITS序列分析J.临床和实验医学杂志，2022，56：646.14徐红，李晓波，丁小余，等.中药黄草石斛rDNAITS序列分析J.药学学报，2001，3610：777.15王淑美，梁生旺，周开亚，等.牛膝的rDNAITS序列分析J.中草药，2022，355：559.16沈洁，丁小余，张卫明，等花椒及其混淆品的rDNAITS区序列分析与鉴别J.药学学报，2022，401：80.17丁平，方

19、琴巴戟天与常见混伪品的rDNA-ITS序列分析及其分子鉴定J.中草药，2022，366：908.18刘忠权，郝明干白花蛇舌草的rDNAITS序列鉴定J.陕西中医，2022，262：167.19曾明，马雅军，郑水庆，等.中药葛根及其近缘种的rDNA-ITS序列分析J.中国药学杂志，2022，383：173.20高晓霞，陈晓颖，罗源生，等.佛手及其近缘种香橼rDNAITS-RFLP初步分析J.长春中医药大学学报，2022，224：77.21余永邦，秦民坚，梁之桃，等.不同产区太子参的rDNAITS区序列的比拟J.植物资源与环境学报，2022，124：1.22王东，白雁，陈志红.不同产地山药rDNAITS区序列的比拟J.时珍