生物化学2.1蛋白质性质

1、蛋白质的变异与分子病 分子病 指蛋白质分子中由于AA排列顺序与正常蛋白质不同而发生的一种遗传病(基因突变造成的)。镰刀形贫血病：病因：血红蛋白AA顺序的细微变化 -链N端氨基酸排列顺序 1 2 3 4 5 6 7 8 Hb-A（正常人） Val-His-Leu-Thr-Pro-Glu-Glu-Lys Hb-S（患 者） Val-His-Leu-Thr-Pro-Val-Glu-Lys镰刀形贫血病：病人体内血红蛋白的含量乃至红细胞的量都较正常人少，且红细胞的形状为新月形，即镰刀状。此种细胞壁薄，而且脆性大，极易涨破而发生溶血；再者，发生镰变的细胞粘滞加大，易栓塞血管；由于流速较慢，输氧机能降低，使

2、脏器官供血出现障碍，从而引起头昏、胸闷而导致死亡。镰刀状红细胞与正常血红细胞.镰刀状红细胞贫血:病变细胞正常红细胞镰刀形红细胞正常红细胞与镰刀形红细胞的扫描电镜图 谷氨酸在生理pH值下为带负电荷R基氨基酸，而缬氨酸却是一种非极性R基氨基酸，就使得HbS分子表面的荷电性发生改变，引起等电点改变，溶解度降低，使之不正常地聚集成纤维状血红蛋白，致使红细胞变形成镰刀状,输氧功能下降,细胞脆弱易溶血.镰刀型贫血病镰刀状红细胞贫血:变形及后果镰刀状红细胞的疏水基团造成聚集这种聚集造成镰刀型血红蛋白纤维化镰刀型血红蛋白的地域性非洲大地流行疟疾，使人类在进化中作出痛苦的选择 疟原虫 疟原虫 杂合子 父系HbS

3、 疟疾 母系HbS 正常人 单系HbS 可抵抗疟原虫 使人患疟疾 可活到30岁左右 童年死亡 死于疟疾 但可有生育能力 一、两性解离性质及等电点二、蛋白质胶体性质三、蛋白质的沉淀四、蛋白质的变性与复性五、蛋白质的紫外吸收特性六、蛋白质呈色反应第六节 蛋白质的重要性质分离纯化手段第六节 蛋白质的性质和分离纯化手段一 、蛋白质的相对分子量蛋白质相对分子量在10 0001 000 000之间。测定分子量的主要方法有渗透压法、超离心法、凝胶过滤法、聚丙烯酰胺凝胶电泳等。最准确可靠的方法是超离心法（Svedberg于1940年设计）：蛋白质颗粒在2550*104 g离心力作用下从溶液中沉降下来。沉降系数

4、（s）：单位（cm）离心场里的沉降速度。沉降系数的单位常用S，1S=110-13（s） v =沉降速度（dx/dt）=离心机转子角速度（弧度/s） x =蛋白质界面中点与转子中心的距离（cm） s = v2x离心机图示二、蛋白质的两性解离及等电点蛋白质在其等电点偏酸溶液中带正电荷，在偏碱溶液中带负电荷，在等电点pH时为两性离子。电泳：带电颗粒在电场中移动的现象。分子大小不同的蛋白质所带净电荷密度不同，迁移率即异，在电泳时可以分开。1. 自由界面电泳：蛋白质溶于缓冲液中进行电泳。区带电泳：将蛋白质溶液点在浸了缓冲液的支持物上进行电泳，不同组分形成带状区域。3. 纸上电泳：用滤纸作支持物。等电聚焦

5、电泳：当蛋白质在其等电点时，净电荷为零，在电场中不再移动。+5.06.07.0稳定pH梯度通电5.06.07.0稳定pH梯度+三 、蛋白质的胶体性质蛋白质溶液稳定的原因：1）表面形成水膜（水化层） 2）带相同电荷 （双电层）布郎运动、丁道尔现象、电泳现象，不能透过半透膜，具有吸附能力酸酸碱碱碱酸 溶液中蛋白质的聚沉 COO- COO- COOH + H+ + H+ Pr Pr Pr + OH- + OH- NH2 NH3+ NH3+PHPI PH=PI PHPI用于分离物质的原理：以生物大分子为例阐明电荷来源：四、蛋白质的沉淀反应1. 加高浓度盐类（盐析）：加盐使蛋白质沉淀析出。分段盐析：调节

6、盐浓度，可使混合蛋白质溶液中的几种蛋白质分段析出。血清球蛋白（50%(NH4)2SO4饱和度），清蛋白（饱和(NH4)2SO4)。蛋白质胶体溶液的稳定性与它的分子量大小、所带的电荷和水化作用有关。改变溶液的条件，将影响蛋白质的溶解性质在适当的条件下，蛋白质能够从溶液中沉淀出来。盐析 在蛋白质的水溶液中，加入大量高浓度的强电解质盐如硫酸铵、氯化钠、硫酸钠等，可破坏蛋质分子表面的水化层，中和它们的电荷，因而使蛋白质沉淀析出，这种现象称为盐析。 而低浓度的盐溶液加入蛋白质溶液中，会导致蛋白质的溶解度增加，该现象称为盐溶。盐析的机理： 破坏蛋白质的水化膜，中和表面的净电荷。盐析法是最常用的蛋白质沉淀方

7、法，该方法不会使蛋白质产生变性。 各种蛋白质的亲水性及荷电性均有差别，因此不同蛋白质所需中性盐浓度也有不同，只要调节中性盐浓度，就可使混合蛋白质溶液中的几种蛋白质分散沉淀析出，这种方法称为分段盐析。不可逆沉淀在强烈沉淀条件下，不仅破坏了蛋白质胶体溶液的稳定性，而且也破坏了蛋白质的结构和性质，产生的蛋白质沉淀不可能再重新溶解于水。由于沉淀过程发生了蛋白质的结构和性质的变化，所以又称为变性沉淀。如加热沉淀、强酸碱沉淀、重金属盐沉淀和生物碱沉淀等都属于不可逆沉淀。不可逆沉淀的常用方法：1. 加有机溶剂2 加重金属盐3. 加生物碱试剂单宁酸、苦味酸、三氯乙酸能沉淀生物碱，称生物碱试剂可逆沉淀在温和条件

8、下，通过改变溶液的pH或电荷状况，使蛋白质从胶体溶液中沉淀分离。在沉淀过程中，结构和性质都没有发生变化，在适当的条件下，可以重新溶解形成溶液，所以这种沉淀又称为非变性沉淀。可逆沉淀是分离和纯化蛋白质的基本方法，如等电点沉淀法、盐析法和有机溶剂沉淀法等。五、蛋白质的变性蛋白质的性质与它们的结构密切相关。某些物理或化学因素，能够破坏蛋白质的结构状态，引起蛋白质理化性质改变并导致其生理活性丧失。这种现象称为蛋白质的变性(denaturation） 发生变性的蛋白质一级结构（构型）和分子量不变，高级结构（构象）遭到破坏。变性蛋白质主要标志是生物学功能的丧失。溶解度降低，易形成沉淀析出，结晶能力丧失，分

9、子形状改变，肽链松散，反应基团增加，易被酶消化。有些蛋白质的变性作用是可逆的，其变性如不超过一定限度，经适当处理后，可重新变为天然蛋白质（复性作用）。变性蛋白质通常都是固体状态物质，不溶于水和其它溶剂，也不可能恢复原有蛋白质所具有的性质。所以，蛋白质的变性通常都伴随着不可逆沉淀。引起变性的主要因素是热、紫外光、激烈的搅拌以及强酸和强碱等。变性作用 蛋白质复性四.蛋白质分离纯化的一般程序1.前处理 生物组织 破碎、溶解、离心分离 蛋白质提取液2.粗分级 盐析、等电点沉淀、超滤、有机溶剂分级分离3.细分级 层析、电泳 精制品4.结晶 结晶或冻干粉 适宜介质2、根据溶解度分等电点沉淀盐析（常用硫酸铵

10、）有机溶剂沉淀3、根据电离性质分电泳离子交换层析1、根据分子大小分透析或超滤离心沉淀凝胶过滤层析四、分离纯化的方法4、特异亲和力： 亲和层析沉降平衡离心法沉降速度离心法蛋白质的分离纯化测定（一）根据分子大小不同进行分离纯化1、透析和超过滤 透析和超过滤都是利用蛋白质分子不能通过半透膜的性质，使蛋白质和其它小分子物质分开。 超过滤是利用压力或离心力，强使水和其它小分子溶液透过半透膜，而蛋白质留在膜上。凝胶过滤又称分子筛层析（molecular-sieve chromatography)。这是根据分子大小分离蛋白质混合物最有效的方法之一。凝胶过滤是一种柱层析，柱中的填充物是大分子的惰性聚合物，最常

11、用的有葡聚糖凝胶（商品名为Sephadex)和琼脂糖凝胶（商品名为.Sepharose）等。葡聚糖凝胶是具有不同交联度的网状结构物，它的“网孔”大小可以通过控制交联剂与葡聚糖的比例来达到。不同型号的葡聚糖凝胶装在层析柱中，不同分子的蛋白质混合物借助重力通过层析柱时，比“网孔”大的蛋白质分子不能进入凝胶颗粒的网格内，而被排阻在凝胶粒之外，随着洗脱剂通过凝胶粒外围而流出；比“网孔”小的分子则扩散进入凝胶粒内部，然后再可逆地扩散出来通过下层凝胶。这样，由于不同大小的分子所经路程不同而得以分离，大分子先洗下来，小分子后洗下来。 凝胶过滤层析原理凝胶层析葡聚糖的合成亲合层析 亲和层析 ( affinit

12、y chromatography）是分离蛋白质的一种极为有效的方法。它经常只需经过一步的处理即可使某种待提纯的蛋白质从很复杂的蛋白质混合物中分离出来，而且纯度很高。这种方法根据的是某些蛋白质所具有的生物学性质，即它们与另一种称为配体的分子能特异而非共价的结合。亲和层析（二）根据电荷不同的分离方法1.电泳 在外界电场的影响下，如果蛋白质不处于等电点状态，它将向电极移动，这种现象称为电泳。纯化中应用最多的是聚丙烯酰胺凝胶电泳和等电聚焦电泳，它们既可以作为蛋白质纯度检验方法，也可以纯度、制备蛋白质。电泳的影响因素1. 待分离大分子的性质 ：所带的电荷、分子大小和形状，分子带的电荷量越大、直径越小、形

13、状越接近球形，则其电泳迁移速度越快 2. 缓冲液pH和离子强度：pH值距离其等电点愈远，其所带净电荷量就越大，电泳的速度也就越大 ；但是pH过高或过低引起蛋白变性，缓冲液通常要保持一定的离子强度；强度过低，则缓冲能力差，不易维持PH恒定，离子强度过高，在待分离分子周围形成较强的带相反电荷的离子扩散层（即离子氛），降低了蛋白质的带电量，使电泳速度减慢。一般所用离子强度为0.02-0.2之间。凝胶电泳法 本实验以醋酸纤维膜为电泳支持物，分离各种血清蛋白。临床医学常用血清蛋白间相对百分比的改变或异常区带的出现作为临床鉴别诊断的依据。 醋酸纤维膜是由醋酸纤维加工制成的一种细密且薄的微孔膜。广泛应用于医

14、学临床中各种生物分子的分离分析中，如血清蛋白、血红蛋白、球蛋白、脂蛋白、糖蛋白、甲胎蛋白、类固醇及同工酶等。它具有微量、快速、简便、分辨力高，对样品无拖尾和吸附现象等优点。电渗作用虽然较高但很均一 ，不影响样品的分离效果。不足之处是分辨率比聚丙烯酰胺凝胶电泳低，由于薄膜厚度小（约10100m），样品用量很少，不适于制备。 血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳（cellulose acetate membrane electrophoresis）+白蛋白(A)12（三）血浆蛋白的分类 通过盐析法将血浆蛋白质分为清蛋白和球蛋白两大类。通过醋酸纤维膜电泳或琼脂糖凝胶电泳将血浆蛋白质分成清蛋白和1、2、-球蛋白等

15、五个主要区带 。电泳照片示例凝胶电泳法五 蛋白质含量的测定（一）蛋白质含量的测定：1.紫外光吸收法：此法是用紫外吸收分光光度计在紫外光区测定蛋白质的光吸收，从而测定蛋白质含量的方法。 2.双缩脲法在强碱性溶液中，蛋白质与CuSO4反应，生成紫红色化合物，这个反应称为双缩脲反应（biuret reaction)。在碱性条件下，蛋白质与CuSO4所生成的颜色深浅与蛋白质的浓渡成正比，而与蛋白质的分子量及氨基酸组成无关。将样品同标准蛋白质同时试验，并于540-560nm波长下侧其光吸收值，通过标准曲线曲线即可求得蛋白质的含量。此方法简便、迅速，不受蛋白质特异性的影响，但方法的灵敏度较差，所需样品量大

16、（0.2-1.7mg/ml）。3福林一酚试剂法福林一酚试剂（Folin-phenol reagent )包括两组试剂：碱性铜试剂和磷钼酸及磷钨酸的混合试剂。碱性铜试剂与蛋白质产生双缩脲反应，这是蛋白质中肽键的反应，这种被作用的蛋白质中的酚基（酪氨酸），在碱性条件下很容易将磷钼酸和磷钨酸还原为蓝色的钼蓝和钨蓝，所生成蓝色的深浅与蛋白质的含量成正比，因此，在650nm或660nm波长下测定光吸收值，即可测定蛋白质含量。这个方法实际上是劳里（Lowry, O, H., 1951）在原方法的基础上加以改进了的，常称Lowry法，具有操作简便、灵敏度高（比双缩脲法灵敏100倍）等优点。蛋白质测定范围为25-250g/ml。但不同蛋白质显色强度稍有不同，而且酚类物质和柠檬酸有干扰。 一、蛋白质通论一、蛋白质的元素组成 二、蛋白质的分类 三、蛋白质的大小与分子量四、蛋白质的功能五、蛋白质构象和蛋白质结构的组织层次二、蛋白质的基本结构单位氨基酸一、蛋白质的水解二、氨基酸的一般结构特点及其分类三、氨基酸的两性性质和等电点四、氨基酸的化学反应五、氨基酸的旋光性和光吸收 本章总结三、肽一、肽与肽键的结构二、肽单位（二面角）三、肽链中AA的排列顺序和命名四、天然存在的活性肽四、蛋白质的分子结构一、蛋白质的一级结构（蛋白质一级结构的测定）二、蛋白质的二级结