荧光定量PCR仪操作指南eppendorf

1、目录：安全预防法安装交货包装仪器的安装功能性单元Mastercyclereprealplex启动realplex模块与热模块之间的连接Mastercyclereprealplex与计算机之间的连接与其余部件的连接realplex软件的安装安装主程序数据恢复开始realplex软件的运转操作管理者登陆登陆用户改正系统配置对使用者的管理新用户建立编写用户删除用户用户层循环仪realplex模块系统层特征登陆出错信息用户登陆软件更新检测项目管理建立检测项目打开检测项目保存检测项目保存模板文件模板文件的使用复制检测项目检测项目的输出检测项目的输入建立文件夹删除检测项目和文件夹探针管理染料管理校准背景校

2、准颜色校准使用商业的校准工具包进行的颜色校准客户独有的染料的校准数据库管理当前数据库的自动保存当前数据库的保存输入数据库数据库的归档编程（检测项目的建立）建立一个新的检测项目建立板布局染料的确定参照染料的选择样本容积输入探针种类的确定背景的确定样品种类的定义标准阳性比较阴性比较未知样品复制和标准系列的自动建立定量的样品种类相对定量的样品种类多plex分析例子单plex分析的例子熔点分析中的样品种类终点测定中的样品种类+/-检测项目中的样品种类基因鉴别中的样品种类样品的复制与剪切删除样品几个样品的归组子检测项目的测定板布局的删除完好检测项目的板布局编写pcr程序的建立用模板程序建立一个pcr程序

3、不用模板程序建立pcr程序程序步的插入和编写温度循环（15步循环）保温暂停声音溶化曲线终点程序的复制程序的删除丈量点的确定热盖设置操作（监测）样品的加载模块温度控制样品体积启动检测项目单个样品的选择单个样品种类的选择循环仪状态当前运转检测项目的中断连续运转检测项目停止检测项目mastercyclereprealplex作为pcr的使用mastercyclereprealplex作为荧光计的使用关闭6分析大纲打开检测项目打开在运转的检测项目打开子检测项目单一检测项目的选择使样品处于不活动状态样品种类的选择分析模式的选择图标缩放储存默认设置图表的保存和复制样品数据的保存和复制编写报告模板报告的应用

4、分析的保存调用分析定量阈值确立基准线测定标准曲线分析multiplex分析相对定量阈值的测定多plex分析的估量单plex分析的估量溶化曲线分析阈值的测定分析终点丈量标准曲线分析+/-检测项目将终点测定作为数据源的+/-检测项目分析模式阈值的测定pcr数据作为数据源的+/-assay阈值测定分析多plex分析基因测定阈值测定分析保护洁净仪器的一般方法热模块的洁净热模块的考据与校准故障查找一般故障在sybr绿色分析中发生的错误qrtpcr过程中发生的错误登陆新用户的建立创办一个检测项目检测项目的保存执行检测项目归纳板布局pcr程序开始检测项目当前运转检测项目的中断连续运转检测项目退出检测项目分析

5、技术数据功能性单元Mastercyclereprealplex图1：关闭的realplex模块前面观1realplex模块状态显示密封压板（锁住状态）4控制面板的挂钩（Mastercyclereprealplex不需要）热模块图2：打开的realplex模块前面观密封压板（开启状态）realplex模块热模块放入试验样本后，向前拉动realplex模块，覆遮住插入的试管。而后用压板密封，程序开始启动。注意在把密封压板归位时当心不要弄伤手指。当realplex模块开启时，不要触碰盖子下端以防被灼伤。开始realplex软件的运转打开mastercyclereprealplex的开关，等候位于开关

6、上部的LED灯将变成绿色。此刻您可以开始运转realplex软件了。您也可以在mastercyclereprealplex处于关断状态下运转realplex软件，甚至在不接任何硬件的状态下运转该软件。第二种状况下，软件将会提示一条错误信息，可以忽视该信息连续运转软件。注意：当使用realplex软件时，不要运转其余会占用计算机大部分内存的软件（如：CD创建器也许媒体播放器等）！决不行以使计算机工作在电池供电模式！调整计算机供电电源的设定值以保证在程序运转过程中，计算机不会进入待机状态。操作管理者登陆当realplex软件第一次被打开时，将会显示以以下图的一个登陆对话框，提示软件管理者为Eppe

7、ndorf命名并输入登陆密码。这项是仪器的出厂设置，若有需要用户可以在UserAdministrator对话框中对此项进行更正（详细状况请查阅节）。此后软件再次被打开时，无论软件管理者还是其余的软件使用者，都一定建立一个用户才能登陆使用realplex软件。登陆在打开程序时，Mastercyclereprealplex用户都一定先登陆才能进一步使用软件。所有用户名都列在采纳框中。我们要做的就是选出自己的用户名并输入相应密码。新用户由软件管理者建立。（请参阅节）假如登陆密码输入错误，则会显示登陆失败（loginfailed）。点击OK键确认后，重新进入登陆程序。假如点击Cancel键，则显示主屏

8、幕（情参阅节）。但是此时所有的功能键都会处于无效状态。为进入工作状态，使用者一定再次打开登陆对话框（情参阅节）达成登陆手续。注意：登陆此后，用户可以对自己的文件夹和分析程序进行读也许写的操作，与Mastercyclereprealplex仪器连接后可以执行其余的实验操作。而对软件其余用户的文件夹和分析程序只有读的权限。假如想要执行或编写其余用户的分析程序的话，可以将其复制到自己的文件夹中。用户改正当已有其余使用者登陆时，可以依据以下方法登陆系统：经过点击该图标以退出登陆。假如选择登陆图标，Userlogin对话框将被弹出，使用者可以依据节中描述的登陆步骤进行登陆。以上两种功能也可以经过File

9、菜单来实现。软件在同一时刻仅同意一名用户登陆，新用户的登陆将自动使本来的使用者退出系统。当前登陆用户将被显示在屏幕下方的状态栏内。登陆后，主屏幕显示为Administror也许User。主屏幕包含导游区，工作区和状态区。如果在左边的导游栏内选定某一程序函数时，该程序函数则会显示在工作区内，而状态栏中将显示热模块的状态信息和当前使用者的用户信息。菜单栏工具栏导游区工作区状态栏经过选项show/hidenavigator，导游区可以被显示也许隐蔽。这一操作也可以经过setup菜单实现。注意：所有的对程序各个功能的操作以及对系统配置的操作，都可以经过工具栏也许菜单栏实现。选择性的操作还可以经过点击鼠

10、标右键来实现。系统配置在setup菜单中选择systemconfiguration项，则在菜单栏中显示realplexsystemconfiguration对话框。此中对话框左边列出了所有的使用者名单以及处于连接状态的模块名单，其余还有系统设置及其功能的结点选项。在导游栏内不一样的层次显示为不一样的符号。当用光标选中某个结点时，隶属文件夹将变成可见的，再选一次则可关闭该结点。假如某层或其隶属文件夹被选中，将在对话框的右边显示出相应的窗口内容。对使用者的管理当选中User项，UserAdministration图表显示在对话框右边，列出所有的用户名单。软件管理者登陆系统此后，可以使用该对话框进行

11、建立新用户，编写和删除已建立的用户的操作。循环仪在cycler结点处，可以获取已连接的循环仪的信息。设备特征被列在properties图表下。其余相应硬件的资料以及最后登陆的用户名，还有最后运转的程序都会在此栏下显示出来。在incubate和lid图表下，可以调整热模块和加热盖的温度值。详细做法为第一在newtemperature一栏中填入所需的温度值，而后选择incubate复选框以确认。如停止调温，则开释incubate复选框。PCR程前言档信息在protocol图表下显示。第一给出了启动PCR程序的登陆用户的信息以及该PCR程序的程序名和启动时间。接下来是相关的程序特征信息和热盖设置。除

12、此以外，程序的运转各步骤也会在此显示出来。假如选中这个功能键，则原始记录将被作为txt文件保存。假如选中这个功能键，则原始记录将被与计算机相连的打印机打印出来。在Cycler结点处双击鼠标，System结点就会显示出来，此中包含有模块的特征信息。特征：properties栏中显示出模块的型号以及热模块的序列号，同时热模块被最后验定和校定的信息也会显示出来。Sensors：显示当前传感器的温度值。温度验定：经过温度传感器对仪器的温度值进行丈量，属于仪器温度验定系统的一部分（请详见命令信息）。该过程在温度验定系统的操作手册中有详细描述。温度校定：借助于温度传感器，对仪器的温度值进行的调整操作。其性

13、能在温度验定系统的操作手册中有详细描述。realplex模块在realplexmodule结点下将显示realplex模块的特定的系统信息。除了显示mastercyclereprealplex仪器的版本信息和软件的版本信息以外，其余装置件的序列号也会在此显示出来。同时还有滤波器设备资料和光电倍增器所选电压值。Realplexmodule还会指明设置realplex模块的CAN总线地址以及热模块和realplex模块之间能否是经过CAN总线电缆相连的。Coverstate一栏中显示出加热盖的当前地址。在realplexmodule结点处双击鼠标左键打开基层各结点。Modulelog文件目录下记录

14、了程序运转中出现的所有出错信息。这一图表中的出错信息可以经过选中save功能键以txt格式保存下来，也许选中print功能键经过已连接的打印机打印出来。检测项目管理在工具栏中可以实现以下的检测项目的管理功能：新检测项目打开检测项目保存检测项目打印报告将文件输入当前的选中部分将当前的选中部分输出注意：以上说起的各个功能还可以经过file菜单，也许把鼠标放在导游栏中点击右键来实现。建立检测项目当选中newassay图标时，将出现一个空白的板块，标准的pcr程序将在工作区内被装载。打开检测项目当选中openassay图标此后，将弹出检测项目对话框：假如一个用户也许文件夹处于选中状态时。除了文本名、成

15、马上间和更新时间会在assays面板上显示出来以外，所有保存此中的检测项目也都会在右边显示出来。并且还会提示出各文本的状态。标有setup的文本代表从没被打开过。打开文本时，文本将被装载在assaysetup和analysis中，并且在analysis中没有数据资料。标有template的文本可以作为建立新文本的模板文本使用。更多相关信息请详见和节的关于模板文本的建立日期和使用的介绍。标有complete的文本代表数据获取已经发生过的文本。假如这样的文本被打开，数据将会显示在analysis下。并且除非有其余文本当前正在被运转的状况下，该文本才会显示在assaysetup中。详见节中的介绍。当

16、某个文本被选中，该文本中保存的所有分析数据都将被显示在下方的analysis窗口中。数据建立和执行这些分析的用户名都会被在这里列出来。因为断电也许系统发生错误等原由造成失败的文本都带有这个aborted的标记。假如在发生失败前获取了足够多的数据，那么该文本还是可以被拿来分析的。保存检测项目检测项目可以由登陆用户在他的结点下也许文件夹中执行保存操作。只有登陆用户才能执行对这些程前言件的编写操作。而其余使用者只好对这些文件执行读也许复制的操作。当saveassay的图标被选中后，当前的检测项目被执行保存操作。当要把一个检测项目保存在某目标文件夹下时，可以选中file菜单下的saveas功能键，打开

17、相关对话框来实现。输入检测项目名后，文本经过复选框assaytype被选中，点击ok以确认。保存模板文件当一个检测项目要在被创办此后多次重复使用时，该文件将被保存为模板文件。详细方法为在保存文件的过程时，复选框中选择template栏。模板文件的使用当创办简单的新检测项目时可以用到模板文件。详细方法：模板文件在assaysetup经过功能键openassay中被装载，以检测项目的形式，命名后保存在用户结点下。复制检测项目用户可以复制其余用户的文本到自己的文件夹,对这些文本与模板进行启动和编写。详细方法为：在assay对话框中使用openassay选中和打开其余用户文件夹下相关的检测项目，而后经

18、过saveas将文本复制到自己的结点下（请查阅节）。这时用户就可以在连接mastercyclereprealplex此后，直接启动和执行复制的检测项目了。检测项目的输出检测项目的输入输出功能用于几个工作站之间的文本交换。在此检测项目与板布局、序和被测数据一同被输入输出。PCR程图标exportassaytofile用来以ASY格式保存当前的检测项目到另一个工作站上的计算机上以便对文本做更多的办理。在窗口的靠上一栏中选出检测项目的保存地址，而后输入文本的名字，并在中选择realplexexchange（*.asp）。filetype一栏检测项目的输入当选中图标importassayfromfil

19、e时，一个格式为ASY的检测项目就会被装载到一个空白的文本中。当输入一个检测项目时，一定在窗口的靠上一栏内选中一个相关的保存地址，文件种类为realplexexchange（*.asp）。建立文件夹登陆用户可以在自己用户结点下建立文件夹，相关的文件和文本都在这个文件夹中保存，以方便往后的调用。依据以下的步骤建立文件夹：经过图标openassay打开检测项目的对话框。选中自己用户结点后，经过功能键new来增加一个新的文件夹。可以第一经过选中文件夹，而后再点击功能键rename来重新命名。而后检测项目就可以在建立的文件夹中进行复制和创办等操作了。（请查阅和节）删除检测项目和文件夹经过图标opena

20、ssay，用户可以在检测项目对话框中，点击功能键delete来删除选中的检测项目，最后点ok确认删除操作。相同的删除操作可以用来删除文件夹。选中一个检测项目也许文件夹后，可以经过点击功能键delete，和确认yes来删除该检测项目也许文件夹。染料管理选中dyes图标后，将会弹出相对付话框。这个对话框用于实现对染料的管理。在荧光丈量中，染料是一定被适合设定的。相应染料的最大发射波长关于用户选择适合滤光片(如FAM520nm与一号滤光片520+/-5nm）滤光片是特别重要的。请向各自的生产商咨询所需染料的最大放射量。注意：在执行颜色校准（请查阅节）前，一定先定义相应的染料。染料名称染料最大的发射波

21、长，单位为纳米（nm）染料检测通道。基于特定的染料波长有程序早先自动设定。详细染料校准时的光电倍增器的敏感度。包含有四位数码，用来为四个滤光片中的每一个设定相应数值（1代表低敏感度，9代表高敏感度）。该数码由软件早先设置。最后一次执行染料校准的用户最后一次校准时间。在点击此键此后所显示的对话框中，新染料的所有数据都可以在这里输入进来。这个对话框用来输入新染料的名称和检测新染料的滤光片。滤光片一定与新染料的发射波长相般配。当前染料的所有数据都可以在点击此键此后显示的对话框中更正。按ok以确认。点击此键后，选择yes确认删除的染料。注意：假如染料的滤光片发生改变的话，将会失掉染料的校准资料。校准在

22、使用mastercyclereprealplex做荧光试验时，需要早先进行背景和颜色校准。校准应和随后的试验处于相同的温度下。注意：为保证密封盖上没有液体，溶液内没有空气泡，校准前应第一对校准板进行离心操作。必定要保证没有液体蒸发，不然使用新的校准板。在校准前，要保证仪器已经启动了最少15分钟。注意：软件会自动确立每个染料和滤光片所需的光电倍增器敏感度。入。背景校准一定要在颜色校准以前执行。所以用户无需有任何输背景校准选中菜单栏setup后，就会弹出backgroundcalibration对话框，列出所有保存的背景校准。该列表还列出了校准时间和执行校准的用户名。除此以外还显示了背景校准的状态

23、。使用的板名称作为默认设置的背景校准，带有十字标记。光电倍增器的敏感度在染料校准过程中以四位数码的形式被确立下来。四个滤光片中，每个滤光片都对应确立一个数码（1代表低敏感度，9代表高敏感度）。这四个数码由软件早先设定。执行背景校准的日期执行背景校准的用户一个新的背景校准过程会在点击该栏后出现的对话框中进行。对话框new被打开后，输入背景板的名称。在右边的对话框的incubation栏中，输入模块和盖子的温度值。模块温度的缺省值为60摄氏度，盖子温度的缺省值为105摄氏度。插入背景板此后，单击功能键calibrate开始执行校准，单击ok键确认操作。在加热和第一次读值达成后，软件会提示翻转背景板

24、，请依据软件的提示操作，翻转背景板，单击ok确认操作。假如背景校准成功达成的话，背景板会显示出96个绿色地址的板布局。单击ok确认以关闭“校准成功达成”提示框。假如背景板在校准过程中的某些地址校准失败时，单击cancel来放弃校准数据。在这类情况下，上次的校准数据将被用来使用。选中proceed键时，背景校准数据在任何状况下都会被除去。在显示的对话框内，可以改变当前背景校准的所有的数据，而后校准过程被重复进行。上次的背景校准的数据将被覆盖。当选中功能键default时，关于所有的检测项目来说，校准都为默认设置。此时在背景校准列表中，将显示一个十字标记。点击yes来确认对背景校准的删除。背景校准

25、失败的另一个原由可能是热模块内一些容器内的荧光污染造成的。热模块的洁净请详见节。数据库管理所有的数据、设置值、用户结构都自动保存在数据库中，介绍用户按期为数据库建立备份。注意：不要混淆不一样器皿的数据库。Databasetool软件可以用来管理数据库。双击图标databasetool后，显示出realplexdatabaseadministration对话框。上面的selecteddatabase面板显示出当前数据库和其当前状态。DatebasesandArchives图表显示了所有可用数据库的列表。共有两种形式的数据库：实质使用的数据库，此中的数据都是当前储存的。数据库的名字由数据和数据库开

26、始使用的日期构成。在selecteddatabase面板中，数据库被打开后，显示为绿色。档案文件数据库都处于只读状态，储存以前的数据。这类数据库由档案和建立数据库的日期构成。在selecteddatabase面板中，跟着数据库的被关闭，数据库显示为红色。假如在列出的数据库中选中此中一个时，这个数据库将显示在selecteddatabases面板中，并且与realplex软件连接起来。假如选中功能startrealplex的话，realplex软件会被直接打开。当前数据库的自动保存打开realplex软件后，一个备份将以一个正式基本形式自动在目录C:programseppendorfrealpl

27、exsecurity中被保存。关于自动保存的一些设置可以在图表configuration中进行。注意：只有管理者用户才有权利使用图表configuration设置自动保存。注意：当建立的自动备份超出十个时，最初建立的那个备份将被自动删除。所以，介绍按期建立备份。这些备份应该保存在磁板也许服务器上。当前数据库的保存当前数据库副本的保存可以在图表backupdatabase中进行。这一备份包含所有的数据和设定，此中包含检测项目、模板文件、校准数据和用户结构。面板显示了哪一个数据库要进行备份和在图表databases中选中的数据库。平常来讲，备份都是针对数据库和档案文件操作的。备份的名称由软件自动给

28、出。依据源文件，名称可以是数据备份也许档案备份和建立数据。当选中图标browse时，对话框setbackupfilename就会显示出来。当前的数据库将被给予名称，点击功能键save，将该数据库以gbk形式搁置在backup面板上提示的目录下。注意：为了realplex软件可以成功鉴别数据库，需要依据源文件，在每个备份前加上backup_data也许backup_archive。当点击startbackup功能键时，在目录C:programseppendorfrealplexbackup下，建立一个备份文件。该过程被记录在图表log中。备份被自动保存在目录C:programseppendorf

29、realplexbackup下。该目录可以在图表configuration中被更正。假如计算机是一个网络中的此中一台的话，建议将此目录设置在服务器的目录之下。注意：只有管理者用户有权进入图表configurations（详见章内容）。输入数据库在realplex软件中，假如要将本来的数据库的备份激活，当前数据库一定被替代成一个备份文件，详细做法为第一在图表restoredatabase中选中备份文件。点击图标browse后，显示openbackupfiles对话框。点击功能键open后，将在图表restoredatabase中加载以gbk形式保存的数据库。realplexbackup点击功能键

30、startrestore此后，数据库从目录中被加载进来。该过程将被记录在图表log中。C:programs注意：包含有检测项目，设定值，校准数据和用户结构的所有数据会被该数据覆盖。建议在此以前先建立一个当前数据库的备份。为了作为实质使用的主数据库，使用一个已保存的数据库时，要保证所有的校准数据还是有效的。注意：也可以对一个档案文件备份的数据库进行恢复操作。在备份在图表restoredatabase中被加载后，激活复选框createmaindatabasefromarchive执行恢复操作。建议在此之前对当前数据库建立一个备份。所有拥有管理者权限的用户都可以管理数据库。在组合框内选中自己的用户名

31、后，输入用户密码，并按ok确认（请查阅节）。用于realplex软件的密码在此相同是有效的。数据库的归档当数据库大小超出大体250MB时，打开realplex软件时，用户将被提示对数据库进行归档操作。归档后，用户可以以一个新的数据库连续工作，该数据库中包含有所有相关模板文件的设定、校准数据和用户结构内容。只有拥有管理者权限的用户可以进行数据库管理。在组合框中选顶用户名后，输入密码并按ok确认。用于realplex软件中的密码在此相同有效。用户登陆后，可以打开createarchive图表。面板中显示了将要被进行归档操作的数据库，在表databases中选中该数据库。归档名称有软件自动建立，包含

32、有backup_archive和建立日期。选中功能键startarchiving后，在目录c:proguammeeppendorfrealplexbackup下建立一个档案文件。该过程将被记录在表log中。编程（检测项目的建立）mastercyclereprealplex软件基本上包含有两个模块：assaysetup和analysis。模块assaysetup被分为以下三个子项目：platelayout（板布局），pcr程序和监测系统。前边两个子项目用于检测项目的编写，而在监测系统之下，运转的检测项目可以被在线的监测。模块analysis将在本书第六部分中被详细论述。注意：各自使用不一样检测项

33、目的两个模块可以并行操作。即当此中一个检测项目正在运转时，另一个已达成检测项目的分析可以同时进行。（请查阅第6章）建立一个新的检测项目新的检测项目可以经过点击file菜单下的newassay次显示的新建检测项目没有名字，带有隶属项板布局（项建立。在左边窗口的导游栏中，初platelayout），pcr程序（pcrprogram）和监测（monitoring）。假如隶属项此中的一项被选中后，新建检测项目显示在右边的工作区内。其余，经过菜单项commands功能键，不一样的模块也可以被加载到工作区。打开软件后，作为默认设置，在工作区内存在一个可用的空白的板布局。建立板布局为建立一个板布局，选中导游

34、栏左边的platelayout。可以看到右边的pcr板的96个地址。为了对其进行编写，第一要确立被检测的染料。为了方便用户，后续操作的各条指令显示在与工作区相邻的右下方的hints区内。为建立板布局，以下的工具栏内的各个功能都是有效的。清理板未知标准阳性比较阴性比较删除样本构成复制组拆分复制组建立子检测项目删除子检测项目板布局的编写模式注意：其余，以上各个功能还可以经过菜单项目platelayout也许鼠标右键来实现。染料的确定在此，在带有相关滤光片的filterdyes不包含在选项中，一定第一将其增加在菜单栏仪器中。（请查阅节）。面板上，染料经过组合框被选中。假如所需染料setup（请查阅节

35、）下的列表和校准该染料的假如realplex软件与mastercyclereprealplex2相连，那么580nm滤光片和605nm滤光片不会显示在面板上。参照染料的选择参照染料可以在referencedye面板中经过组合框选择。但前提条件是该染料的颜色校准已经执行过了，并且该染料已经在filterdyes中被选好了。没有染料被默认选中。样本体积输入在工作区面板的右上端的samplevol中输入样本的体积。固然这项输入其实不是一定的，但是为了检测项目文件编制的完好，建议达成该项输入。探针种类的确定在板布场面板的右上端，经过组合框选择探针种类。假如所需探针种类不包含在选项内，须第一在setup

36、下增加其到probes列表中。（请查阅）。注意：探针种类的定义不是必定一定的，因为它对pcr程序中的丈量点没有什么影响。必但是为了检测项目文件编制的完好，建议达成该项输入。背景的确定在板布场面板的右上端，经过组合框选择背景的相关板种类。这也是执行检测项目所需的板种类。假如所需的板种类不包含在选项内，一定第一执行该背景的校准。样品种类的定义在板布局中选中一个或更多地址，在被打开的相关对话框中编写，并在随后出现的工具栏中的，经过图标选择不一样的样品种类。以上板布局编写功能也可以经过鼠标右键也许菜单platelayout项实现。当各项输入达成后，带有样品种类、样品名称和sample表中的地址等数据的

37、样品就会显示在左边窗口内。在右边窗口的sampleinfo中，列出了板布局选择样品的各数据。标准当图标standard被选中后，出现相关的对话框。在板布局中样品的地址样品名称目标基因选项的复选框目标基因名称检测目标基因使用的染料标准浓度单元标准浓度内部阳性比较（ipc）选项的复选框内部阳性比较（ipc）染料选项的组合框样品种类符号在这里，各数据和待检测目标基因都以标准名称输入。同时，在相关地域内，一定明确用量和浓度的标准。指数值的标准输入，比方：1E8。单位copies以及用量1都是默认设定的。可以经过autoseries功能来建立标准系列。（请查阅）注意：在这个对话框里可以进行编写的目标基因

38、的数目取决于在板布局中选择的染料的数量。阳性比较选中positioncontrol图标此后，将出现以下的对话框。除了比较的名称和目标基因的数据以外，在此也可以定义基因鉴别（geneidentification）分析模式下，作为等位基因的阳性比较。第一需要达成作为等位基因的阳性比较的编写。在analysis下进行随后的鉴别时，对话框里每个等位基因都被自动分配一个颜色。也可以在amount栏内输入数值。但这在随后的分析中不是绝对必需的。阴性比较当选中negativecontrol图标后，相关对话框被打开。在此对话框中只输入阴性比较的名称和目标基因数据。未知样品当unknown图标被选中后，以下的对

39、话框被打开。除了未知样品名称和目标基因数据以外，经过功能键autoseries还可以在此编写复制。（请查阅节）在对话框的下端包含useoftargetgene(s)as面板和relativequantification/geneexpression面板：useoftargetgene(s)as：可以经过一个内部阳性比较也许选定相关功能键作为持家基因设定目标基因，而后用组合框确立各自的染料。分析中由内部阳性比较也许作为持家基因设定的基因被加亮为黄色。Relativequantification/geneexpression：在此目标基因被定义为relativequantification/gen

40、eexpression分析模式下的校准器。关于monoplex分析，经过组合框wellwithhousekeepinggene(monoplexing)持家基因的孔可以与样品关系。复制和标准系列的自动建立当样品种类为标准（standard）和未知（unknown）时，可以自动建立复制。在编写标准时，也可以自动建立标准系列。第一在要建立标准系列和复制的板布局内最少选择两个地址。为化简标准系列和复制的建立，使用newstandard对话框。此中包含有autoseries项。注意：只有当板布局中超出一个地址被选中后，该功能才能被激活。扩大对话框指了然板布局中被选中的地址，被分为复制和稀释两个地域。复

41、制：在编写框中输入复制的数目，其余，该项也可以用来定义板内复制部署形成基准的形式。关复制可以部署成水平相邻也许垂直相邻的形式。以不一样的方向，不一样的复制可以相邻的排成行也许列。为说明的目的，形式显示在窗口preview中。稀释：使用编写框来明确稀释元素和稀释步骤数。经过组合框order可以明确采纳升序还是降序。相在previewcalculatedamounts栏中，经过组合框选中一个染料，依据在目标基因中定义的浓度初始值，显示浓度最后值。注意：这个地域在unknowns扩大对话框中处于不活动状态。点击ok确认该对话框后，在被选地域内建立起与参数数目相同的组数。当用未知样品建立复制时，整个被

42、选地域被填满。样品名称和所有相关的数据都被自动分配。对应标准系列的单一标准的浓度数据也被自动显示在板布局中。定量的样品种类为了定量样品中的初始核酸，要用一个未知的初始核酸量从样品中建立起一个标准曲线。了这样的目的，第一编写板布局中的标准，而后编写未知样品。阴性比较也要编写。编制标准系列的例子：目标是建立一个10100000拷贝的三重复制子的标准系列，复制部署为相互相邻以行摆列。拷贝的最高数目搁置在地址A1C1上，稀释系列采纳降序，水平列，每步稀释10倍。在板布局中选择地域A1E3打开standard对话框，此中包含附带autoseries项。输入参数点击ok确认输入。为使得板布局为：未知样品复

43、制编程例子：目标是定义未知样品三重复制子目标基因，三倍复制被相邻搁置在地址在板布局上选中地域A1C1。打开包含有autoseries项的unknown对话框。输入各参数。A1C1上。点击ok以确认。使得板布局为：相对定量的样品种类相对定量中，是在目标基因之间做比较，这些基因拥有不一样的表达水平，分别来自经过各自办理的样品中。它们分别与非调控的参照基因（持家基因）对比。而后依据方法计算出其表达水平。所有的样品均作为未知基因进行编写。多plex分析例子在多plex分析中，目标基因和持家基因在一个试管内用两种不一样的染料进行检测。加工过的样品：在板布局中选择B2B4地域打开unknown对话框经过t

44、argetgene（s）面板选择两个基因。经过在housekeepinggene复选框，在useoftargetgene(s)面板中明确持家基因，用组合框选择相关的染料。点击ok以确认。将位于B2B4的样品构成一组。未经办理的样品（校准器）在板布局中选择C2C4地域。打开unknown对话框。经过targetgene(s)对话框选择两个基因经过在housekeepinggene复选框，在useoftargetgene(s)面板中明确持家基因，用组合框选择相关的染料。在relativequantification/geneexpression面板中，选中复选框setsampleascalibra

45、tor来将样品定义为校准器。点击ok以确认。将位于C2C4的样品化为一组。办理过的样品：未经办理的样品：样品被编写达成后，板布局以以下图所示：用作校准器的样品有淡颜色条的标记。单plex分析的例子关于单plex分析，目标基因和持家基因在不一样的试管内接受检测，使用相同的染料。办理过的样品：a）在板布局中选择C2C4地域。打开unknown对话框。在targetgene(s)面板中输入持家基因的名称。经过在housekeepinggene复选框，在useoftargetgene(s)用组合框选择相关的染料。点击ok以确认。将位于C2C4的样品归为一组。面板中明确持家基因，b)在板布局中选中B2B

46、4地域。打开unknown对话框。在targetgene(s)面板中输入目标基因的名称。点击ok关闭unknown对话框。将位于B2B4的样品归为一组。在该组内选中最少一个地址，而后在此打开unknown对话框。经过组合框wellwithhousekeepinggene(monoplexing)向孔内分配（或赋值），此中持家基因在此被检测到。选择C2C4的此中一个包含有持家基因的地址。在计算中，结果将合并分组样品的均匀值。点击ok以确认。办理过的样品（目标基因）办理过的样品（持家基因）未经办理的样品a)在板布局内选择C5C7地域。打开unknown对话框。在targetgene(s)面板中输入

47、持家基因的名称。经过在housekeepinggene复选框，在useoftargetgene(s)面板中明确持家基因，用组合框选择相关的染料。在relativequantification/geneexpression面板中，经过复选框setsampleascalibrator定义样品为校准器。点击ok以确认。将位于C5C7的样品归为一组。b)在板布局中选择B5B7地域。打开unknown对话框。在targetgene(s)面板中输入目标基因的名称。点击ok以关闭unknown对话框。将位于B5B7的样品归为一组。在该组内选中最少一个地址，而后再次打开unknown对话框。经过组合框well

48、withhousekeepinggene(monoplexing)向孔内分配（或赋值），此中持家基因在此被检测到。选择C5C7的此中一个包含有持家基因的地址。在计算中，结果将合并分组样品的均匀值。点击ok以确认。样品编写达成后，板布局以以下图所示：熔点分析中的样品种类在溶化曲线分析中，没有特别需要考虑的方面。终点测定中的样品种类在执行终点测定标准时，阴性比较和未知样品需要被查实。更多细节请查阅节中的内容。+/-检测项目中的样品种类执行一个+/-检测项目时，除了未知样品以外，还需要编写阳性和阴性比较。样品的复制与剪切该过程顶用到的copy,cut和paste命令既可以经过鼠标右键，也可以经过菜单

49、platelayout来实现。为复制板布局样品，第一选中样品，而后经过copy命令复制样品到剪切板上。随后在板布局中选中一个地址，再使用paste命令将样品种类插入此中。Cut命令可以用来剪切样品，而后在板布局另一地址经过paste命令插入该样品。删除样品第一选中一个也很多个样品，而后点击图标deletesamples来删除样品。几个样品的归组除了在节中提到的选项以外，也可以经过将板布局中已存在的样品归为一组的形式建立复制。归为一组的前提是样品种类和其余数据之间是对应的。组内的样品名称不必定要相同。假如板布局内的几个样品被加亮后，再选中group图标，那么这些样品就归为了一个组，可以自动进行复

50、制的统计分析了。被归为一组的样品在板布局内带有颜色加亮的标记，位于板布局的右下方。改变颜色可以通过再次点击groupasreplicates图标。组可以经过点击ungroupreplicates图标撤消。子检测项目的测定在pcr板上执行几个检测项目，单个检测项目会带有子检测项目的标记，可以由软件稍后分别作出分析。这就意味着可以平行的执行两个不一样的检测项目，每个检测项目都可以有各自的拥有不一样目标基因和染料的样品。板布局中给出了一个例子，此中两个以两种不一样标准系列和不一样的未知样品的目标基因被测定。前提条件是这两个检测项目包含有相同的pcr程序，并且数据收集发生在相同的pcr步骤内。假如加亮

51、板布局内的所有子系统的样本，而后选中createsubassay图标，这些样本就会作一个框架的标记。注意：板布局中的空白地址也可以一开始就被选中作为子检测项目。这类方法一般都用在随后进行的检测项目单一样品种类的测定。在程序执行和分析过程中（请查阅节），子检测项目样品的显示是分别执行的。单个子程序和它们在板布局中的地址显示在结点monitoring下，假如选中某一个子程序，与之相关的数据就被加载到右边的工作区中。组可以经过deletesubassay图标被打破。在此以前，要先选中相应的样品。注意：在一个pcr板上执行两个不一样检测项目的前提条件是这两个检测项目用一个pcr程序执行，并且在同一个温

52、度步骤中获取荧光数据。板布局的删除当选中clearplate时，板布局内的所有样本都会被删除。完好检测项目的板布局编写不可以编写完好检测项目的板布局。为了做出随后的变动，第一一定先将板布局激活。经过点击editmodeforplate图标，一个完好检测项目的关闭状态的板布局可以再一次被激活。一旦编写达成，板布局可以经过再次点击该图标被锁住。所有在板布局中并发的改变都会被记录在userlog中。pcr程序的建立为编写pcr程序，工具栏里的所有以以下图所示的功能都是可以用到的：插入步编写步删除步4除去pcr程序显示梯度功能设置丈量点注意：以上这些功能也可以经过鼠标右键也许pcrprogram菜单实

53、现。用模板程序建立一个pcr程序当导游栏内的子项pcrprogram被选中后，一个包含有3步循环的模板程序，作为一个新的检测项目，就会显示在右边窗口中。为编写程序，要先选中此中一步，经过editstep图标弹出对话框，在该对话框中可以更正温度，时间和循环数等数据。其余editstep对话框也可以经过双击某一步弹出。在这个对话框中还可以对增量，梯度功能，制热和制冷率进行设置。（情查阅）其余，经过选中对象和增加，温度，时间和循环数等数据也可以在pcr程序中被直接更正。注意：加热盖和热模块的特征可以在programheader中更正（请查阅节）。不用模板程序建立pcr程序不用模板程序建立pcr程序，

54、第一经过点击clearpcrprogram图标删除整个程序，而后再经过插入程序步来建立一个新的程序。程序步的插入和编写指针用来选择pcr程序地域，在该地域内要插入新的程序步。步总是在光标处的左边被插入。当选中insertstep图标后，弹出相对付话框，在此可以执行各种程序步的插入。当程序步被选中后，它将在光部分的左边被插入。当程序步被插入此后，温度，时间和循环数等数据可以直接在pcr程序中更正。详细做法是先选中而后再增加。在程序步中，假如要更正其余调理点，可以经过点击框中可以进行所有其余设置的改变。editstep图标，在弹出的对话温度温度步可以在程序的任何地址插入。温度步的主要参数，温度以及

55、保持时间都可以在pcr程序的工作区内显示出来，并且可以直接在这里进行编写。温度允许值：4设定的摄氏温度99输入步：时间：以分钟和秒计时的保持时间允许值：1秒到秒输入步：1秒温度步的其余附带功能也可以在这个窗口中实现。Tempincr.代表温度增量：编程中到下一循环的温度步温度的增加/减少的量默认设置：0允许值：010输入步：温度增量：温度减少许：增量在pcr程序步中带有星号：梯度功能当使用梯度功能功能时，热模块的每一列都被设置了不一样的温度值。假如发现复选框上有记号，则可以用光标激该死复选框。一激活，温度符号组from/to就会被开释，而temp和tempincr符号组同时就变成不活动的了。默

56、认设置不活动温度本源左模块边的温度允许值到输入步温度去向右模块边的温度允许值到输入步选中showgradient图标此后，弹出对话框，此中显示了各列的温度值。可以在参数面板中选中一个热模块。其余，梯度温度也可以在这里输入。在pcr程序的步中，梯度功能用附带的下划线来标记梯度温度的最大跨度取决于所使用的热模块（见技术数据）。假如关闭梯度功能，那么在整个模块中，温度分布都是均匀的。Timeincr.的意思为时间增量：代表了编制温度步到下一循环的保持时间的增减量。默认设置：00：00允许值：00：00到01：00输入步：1秒时间增：+时间减：-在pcr程序的步中，增量被标上一个星号：Ramp为制热和

57、制冷率：代表了温度达到设置值的速率。默认值：100允许值：1到75和100输入步：1关于制热和制冷的规程来说，用光标可以输入不一样的ramp值也许挪动图中的拉杆。在输入区内就会显示出当前值。制热和制冷率取决于所使用的热模块（见技术数据值）。设置丈量点：在相关温度步对话框中，选中复选框setmeasuringpoint来明确丈量点。丈量点经过所使用的探针来定义。这其实不是由软件自动设置的。平常来说，在pcr程序，终点分析或熔点分析中获取数据，在一个检测项目中每一项都可以被编写一次。注意：在pcr循环中，只有在温度步中才可以获取数据。而pcr程序是由重复的pcr循环组成的。在每一个pcr循环中获取

58、数据，但是基于计算的软件却只可以在第一个pcr循环内进行。注意：在设置丈量点时，应确准时间步的连续时间是足够长的。关于每个滤光片一种染料，获取数据所需的时间为8秒，而关于每个滤光片两种染料，获取数据所需的时间就要增加到16秒。在pcr程序步中，丈量点被标上相关的符号：注意：丈量点也可以经过图标setmeasuringpoint插入（请查阅节）。移去丈量点，第一需要选中相应的温度步，而后经过editstep对话框也许选中工具栏中的setmeasuringpoint图标来使setmeasuringpoint复选框退出工作状态。循环（15步循环）循环命令包含由一个循环内的温度步数目（1-5），以及执

59、行温度命令的循环次数。默认值：40允许值：1到99输入步：1保温程序保持温度值为输入温度，向来到pcr程序结束。默认值：故而知新允许值：到输入步：暂停程序暂停，温度值保持为最后温度命令值。当点击startporgram键此后，程序连续执行。提示音可以发出声音信号，比方提示程序暂停也许程序执行达成。默认值：9允许值：1到9（信号发出次数）输入步：1溶化曲线insertstep对话框中的meltingcurve选项被自动嵌入四个程序步中。除了溶化曲线的实质步以外，还包含初始变性步，还有初始温度和最后温度的温度步。为测定熔点需要修正参数，第一选中溶化曲线步，而后点击editstep图标。ramp时间

60、：输入建立溶化曲线所需的时间。允许值为530分钟；输入步为1秒；连续测量荧光数据。温度分辨：输入溶化曲线制热率。允许值为；输入步为；加热温度X达成此后开始丈量荧光数据。在pcr程序中，溶化曲线被标上一个记号：终点打开insertstep对话框后，选择终点输入项。就可以很轻松的经过单击图中的数值来编写温度和连续时间的数据。温度额定摄氏温度允许值：输入步：时间：以分秒计的保持时间允许值：01：00-99：59分：秒输入步：1秒程序的复制此过程所需的copy和paste命令可以经过点击鼠标右键也许pcrprogram菜单项看到。复制一个程序步，第一选中程序步，而后使用copy命令将其复制到剪切板上，