食源性病原菌分子分型

1、食源性病原菌分子分型内容安排12月23日 食源性病原菌基因组模板的提取12月30日 食源性病原菌分子鉴定1月6日 食源性病原菌分子分型 10403S（强毒株）：720bp iap + 403bp lmo0038 H4 （弱毒株）： 720bp iap 一. 意义如果某地在食品卫生监督中发现有些食品中被李斯特菌污染，而在此前后，另一些地区发现李斯特菌感染病人持续增加，那么这两者之间有无联系？如何证明？这在过去确实是个十分棘手的工作，因为食源性细菌种类繁多复杂，如果要比较不同来源的两个或多个菌株是否是相同的菌株，必须进行极其繁杂、耗时耗力的分类鉴定和对照。SalmonellaE. coli O15

2、7:H7* Listeria monocytogenes* Vibrio parahaemolyticus30%0.38%0.005-0.01%四大食源性病原菌近年来，已经开发了很多细菌分型方法，使细菌鉴定更加简便快捷。例如：血清学分型、PCR技术等。而近年发展起来的脉冲场凝胶电泳，则是细菌分型的最灵敏的方法，已多次成功用于识别特异性致病菌，追溯食源性疾病爆发的来源，并确定不同地区时间爆发的食源性疾病之间的关联性。 一. 意义传统表型分析法 血清分型、噬菌体分型、多区带酶电泳 分型、酯酶分型 分子(或DNA)分型法 脉冲场凝胶电泳分型 （PFGE） 基于DNA序列的分型技术 核糖体分型 （ri

3、botyping ） 基于PCR的分型技术 二. 分型方法1. 脉冲场凝胶电泳分型（PFGE）PFGE通过选择特定的限制性内切酶，将细菌DNA切成8-25条大小为40-600 kb的条带，然后通过不断变换电流方向，使各条带得到较好的分离 。 可用于分离分子量范围在120 Mb的线状双链DNA分子。当 DNA分子在电泳中朝一个方向移动时，DNA分子沿着电场的方向伸展开，这时，切断电流，DNA则开始回复松弛的无规卷曲状，松弛所需的时间取决于DNA分子的长度。分子越长，回复所需的时也越长。短时间后，一个新的电场加在与原来电场成一定角度的方向，长的DNA分子因还未回复到松弛状态，需要更多的时间才能重新

4、开始朝新的电场方向移动。这样，在这两个方向上反复施加电场，就能使大分子量的DNA分子得到分离。PFGE原理PFGE程序细菌准备，裂解细胞（第一天）SE洗涤-TSE重悬至OD=0.9-溶菌酶-制样品栓-蛋白酶K24h-平衡缓冲液限制性内切酶酶切消化（第二天）新鲜配置限制性内切酶酶切缓冲液-37水浴10-12 h电泳（染色、看结果）（第三天）加样孔中电泳约24h-EB染色30min-UV light观察拍照-BioNumerics分析PFGE分型重复性好，分辨率强； 方法在技术上较复杂，需要特殊的仪器以及操作时需要较长的时间，约需2-3天。 PFGE优缺点目前，采用PFGE技术辅助食源性疾病的流行

5、病学分析，已获得多次成功。例如：1998年美国多个地区发现阿贡纳沙门氏菌感染。随后，追溯到受感染的多个即食谷物制品，都来自同一家食品加工厂。先后对1000多个阿贡纳沙门氏菌分离物进行了PFGE分型，确定了23个州的409个病例与该爆发相关。正是基于PFGE的巨大作用，美国疾病预防和控制中心（CDC）现已建立了分子分型网站PulseNet，采用共享的PFGE分型技术和成果，进行全国范围的食源性疾病监控。 PFGE应用单增李斯特菌食品及环境分离株的PFGE分型比较PFGE-based dendrogram demonstrating the genetic diversity of various

6、 L. monocytogenes strains2110073281056320p8NB001 33ScottA29p310403S HJ12681p6105760194690H401181P1P2P3P5P4P62. 核糖体分型The principle of ribotyping核糖体分型是利用Southern印迹分析来检测与核糖操纵子有关的多态性。DNA由限制性内切酶消化，并经琼脂糖凝胶电泳，分开的限制性片段转移至硝酸纤维素膜或尼龙膜上，加上标记探针，这样即可检出含细菌rRNA基因的限制性片段。 3. 基于PCR的分型技术随机扩增DNA多态性分析分型（RAPD）PCR-限制性片段长度多态性分析分型（PCR-RFLP）扩增片段长度多态性分析分型（AFLP） 重复片段PCR分型（REP-PCR） 4. 多位点序列分析（MLST）对多个基因或基因片段进行测序来确定细菌的亚型及各分离株之间遗传相关性的分型方法。与PFGE及核糖体分型相比，MLST结果明确而且便于解