弓形虫三磷酸核苷水解酶基因的克隆与序列分析

1、弓形虫三磷酸核苷水解酶基因的克隆与序列阐发【摘要】目的:克隆并阐发我国刚地弓形虫三磷酸核苷水解酶NTPase的编码基因。要领:接纳聚合酶链反响PR扩增弓形虫RH株的NTPase基因，克隆入pGE-TEasy载体，转化后挑取阳性克隆举行酶切与测序断定，并对得到的NTPase基因及推导的氨基酸序列举行生物信息学阐发。效果:PR扩增得到特异的弓形虫NTPase基因序列，测序效果表白，得到的弓形虫NTPase-基因全长1812bp，编码的603个氨基酸与Genebank报道的氨基酸序列同源性为100%。经DNAStar猜测NTPase-存在6个埋伏抗原表位。结论:乐成克隆出序列准确的弓形虫NTPase

2、-基因，为其相干研究奠基了基矗【关键词】弓形虫核苷水解酶克隆序列阐发Keyrds:Txplasagndii;NTPase;lning;sequening刚地弓形虫Txplasagndii是专性细胞内寄生的时机致病性原虫，呈天下性漫衍。三磷酸核苷水解酶nulesidetriphsphatehydrlase，NTPase为漫衍于弓形虫速殖子外貌一种重要特异性抗原1，2，其对虫体在宿主细胞内的寄生和生殖都具有紧张的作用3。如今，海内关于弓形虫病诊断和疫苗候选抗原的研究重要会合在P30SAG1和P22抗原4-6，而对NTPase的研究鲜见报道。因此，我们对弓形虫RH株的NTPase基因举行扩增与克隆，

3、为下一步的研究奠基基矗1质料和要领1.1虫株和试剂弓形虫RH株由浙江省医学科学研究院寄生虫病研究所惠赠；E.liDH5为本室保存；pGE-TEasy载体购自Prega公司。淋巴细胞分散液购自Siga公司；限定性内切酶Bgl、Hind和基因组DNA提取试剂盒均为大连宝生物产物；2PRasterix试剂盒购自上海晶美生物技能；小量质粒抽提试剂盒购自宁波中鼎生物技能公司；200bparker及DNA凝胶接纳试剂盒为上海生物工程技能产物。1.2模板DNA制备弓形虫RH株速殖子一连在小鼠体内传代，熏染3d后无菌操纵抽取腹水，虫体用生理盐水洗涤3次，参加与虫体混悬液等量的淋巴细胞分散液，800r/in离心

4、8in后加快至2000r/in离心10in，收会合层虫体7，按DNA提取试剂盒说明书抽提弓形虫基因组DNA，用分光光度法测定DNA的浓度和纯度。1.3PR扩增按照弓形虫NTPase参稽核苷酸序列8和表达载体克隆位点内切酶图谱阐发效果，接纳PrierDesigner引物方案软件自行方案引物，由上海基康生物技能公司合成，引物序列如下：上游引物：5-GAAGATTAAGATATGTATG-3下划线为Bgl酶切位点，卑劣引物：5-GAAGTTTAAGATTGTGAGAATAT-3下划线为Hind酶切位点。接纳2PRasterix试剂盒扩增NTPase基因，PR反响总体积为50l：此中含有模板DNA5l

5、200ng，上卑劣引物各1l终浓度为0.4l/L。同时设立空缺比较。PR反响参数：955in1；9545s，5845s，7260s30；7210in1。1.5%的琼脂糖凝胶电泳断定并切胶接纳。1.4T-A克隆及测序接纳的PR产物与pGE-TEasy载体16留宿毗连。毗连体系为10l：纯化的PR产物3l，2buffer5l，pGE-TEasyVetr1l，T4DNA毗连酶1l。毗连产物转化感觉态E.liDH5，汲取200l转化后的感觉态细菌涂布于含氨苄青霉素的LB平板上，挑选阳性克拢阳性重组子经造就和提取质粒后，别离举行Bgl和Hind双酶切及PR断定，并奉上海基康生物技能公司测序。测序效果接纳

6、DNAAN软件与Genebank宣布的弓形虫NTPase基因9序列举行比力，并推导其编码的氨基酸序列。对得到的基因及其氨基酸序列的同源性、守旧成效域、二级布局等举行生物信息学阐发。2效果2.1PR扩增效果从弓形虫RH株DNA模板中扩增得到预期巨细1812bp的目的条带见图1。2.2序列测定及推导的氨基酸序列的生物信息学阐发3讨论弓形虫NTPase是弓形虫在宿主细胞内情况下得到嘌呤的寄生气制而产生的，对弓形虫的寄生和生殖都具有紧张的作用。体外研究创造，弓形虫产生的NTPase在二巯基化合物的激活作用下，能一连水解全部的三磷酸核苷和三磷酸脱氧核苷至单磷酸情势3。熏染宿主细胞的弓形虫速殖子便是利用N

7、TPase剖析宿主细胞泉源的ATP，以合成维持自身保存所必须的嘌呤核苷酸。NTPase卵白有NTPase-和NTPase-两种亚型，构成两亚型的628个氨基酸中只有16个残基不一样，两亚型的编码基因有31个碱基差异且均不含有内含子9。NakajiaK等8曾报道，利用NTPase-ELISA试验血清学诊断急性弓形虫病与Sabin-Feldan尺度染色试验具有很好的相干性，且NTPase两亚型间的抗原性并无显着区别。Kikuhi等制备的特异性抗NTPase单克隆抗体66可与弓形虫强毒力株和非毒力株的4种差异的NTPase异构酶分子均产生反响，即66可识别4种NTPase异构酶的配合表位10。NTP

8、ase-亚型存在于弓形虫的全部虫株中，且具有强抗原性和较好的免疫反响性。本实行乐成克隆出NTPase-基因，其测序效果与Genbank登岸序列L39079比力，核苷酸序列同源性高达100%，说明NTPase-为高度守旧基因。本实行猜测得NTPase-卵白具有6个埋伏的抗原表位，为我们以后表达重组NTPase卵白用于弓形虫熏染的免疫诊断和疫苗候选抗原的挑选奠基了基矗【参考文献】1KikuhiT,FurutaT,KjiaS.ebranelalizatinanddenstratinfisfrsfnulesidetriphsphatehydr-lasefrTxplasagndiiJ.Parasitlg

9、y,2001,122(Pt1):15-27.2AsaiT,izunF,KjiaS,etal.Highrrelatininanti-bdytitersbeteentheSabin-Feldandyetestandanen-zye-linkediunsrbentassaydetetingiunglbu-linGantibdiestthenulesidetriphsphatehydrlasefTxplasagndiiJ.Jlinirbil,1992,30(5):1291-1293.3BerudesD,PekKR,AfifiA,etal.Tandelyrepeatedgenesendenuleside

10、triphsphatehydrlaseisfrsse-retedinttheparasitphrusvaulefTxplasagndiiJ.JBilhe,1994,269(46):29252-29260.4占国清,吴少庭,高世同,等.弓形虫DNA疫苗团结诱导BABL/小鼠庇护性免疫力的研究J.中国人兽共抱病学报,2022,22(1):89-91.5沈健,仝德胜,钦亚萍,等.弓形虫重要外貌抗原1核酸疫苗与卵白疫苗团结免疫庇护作用的研究J.中国血吸虫病防治杂志,2022,18(3):217-220.6孙怡.弓形虫P30-P22DNA疫苗免疫小鼠诱导的细胞免疫应答J.山东医学高等专科学校学报,202

11、2,28(2):81-83.7郑焕钦,陈发凯,陈不雅今.一种新的弓形虫速殖子纯化要领J.中国寄生虫病防治杂志,1993,6(2):146.8NakajiaK,akikaA,YaashitaN,etal.EvalutatinfserdiagnsisftxplassisbyusingtherebinantnulesidetriphsphatehydrlaseisfrsexpressedinEs-herihialiJ.ParasitlgyInternatinal,2000,48(3):215-222.9AsaiT,iuraS,SibleyLD,etal.BiheialandleularharaterizatinfnulesidetriphsphatehydrlaseiszyesfrtheparasitiprtzanTxpl