DB32-T 3115-2016菊花脱毒种苗生产技术规程-（高清现行）

1、ICS 65.020.20B05备案号：51460-2016DB32江苏省地方标准DB32/T 3115-2016 菊花脱毒种苗生产技术规程Technology of virus-free chrysanthemum stock produce 2016 - 09 - 20 发布2016 - 11 - 20 实施江苏省质量技术监督局发 布DB32/T 3115-2016I 目次 HYPERLINK l _bookmark0 前言II HYPERLINK l _bookmark1 1 范围1 HYPERLINK l _bookmark2 2 规范性引用文件1 HYPERLINK l _bookm

2、ark3 3 待脱毒材料1 HYPERLINK l _bookmark4 4 脱毒处理1 HYPERLINK l _bookmark5 5 病毒检测2 HYPERLINK l _bookmark6 6 脱毒原种苗的保存、扩繁与炼苗移栽2 HYPERLINK l _bookmark7 7 脱毒原种苗的生物性状观察3 HYPERLINK l _bookmark8 8 脱毒原种苗的繁殖3 HYPERLINK l _bookmark9 9 建立脱毒苗母本圃3 HYPERLINK l _bookmark10 10 脱毒种苗的质量检测3 HYPERLINK l _bookmark11 11 包装与贮运3

3、HYPERLINK l _bookmark12 附 录 A （规范性附录） RNA 病毒的反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）检测法5 DB32/T 3115-2016II 前言本标准按GB/T 1.1-2009标准化工作导则 第1部分：标准的结构和编写组织编制。本标准由南京农业大学提出并归口。 本标准起草单位：南京农业大学。 本标准主要起草人：陈素梅、管志勇、吴 丹、张 飞、房伟民、蒋甲福、陈发棣。 DB32/T 3115-2016 PAGE 7 菊花脱毒种苗生产技术规程范围本标准规定了菊花脱毒种苗生产技术要求和规程. 本标准适用于常见菊花脱毒种苗的生产。 规范性引用文件下列文件中的条款通过

4、本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本标准。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本标准。 NY/T 1591-2008 菊花切花种苗等级规格DB32/T 1530-2009切花菊种苗生产技术规程 待脱毒材料凡有待进行脱毒处理的品种均应是通过合法途径引进的，签署有关品种权保护协议，或者经自主选育的、具有知识产权的品种。 脱毒处理茎尖培养脱毒无菌苗再生体系的建立经检测含有特定病毒的菊花，取其越冬脚芽，进行外植体表面灭菌，具体步骤如下：剪除茎段上的叶片，用流动的蒸馏水冲洗15分钟后，用滤纸吸干后，于超净工作台上用75%酒精浸泡30s，再转

5、移到0.1% 升汞中洗涤35min，取出，用无菌水冲洗56次，每次不少于3min，经消毒灭菌后的菊花茎段剪成小段，每段长2-3cm，带有12腋芽，接种于MS培养基中，每个组培瓶12个茎段。 剥取茎尖在超净工作台上操作，于解剖镜下，将材料置于消毒的滤纸上，用经消毒的手术刀和解剖针逐步剥去外层叶片，切取 0.51.0mm 直径大小的带有 12 片叶原基的茎尖顶端组织。 分化培养将剥取的茎尖接种于经过高温湿热灭菌的分化培养基上，并对接种的茎尖分别编号，置于 25、光照强度 15003000lx、光照时间 16h/天的条件下培养，23 个月后可分化出新芽。 诱导生根切取 12cm 分化出的新芽接入生根

6、培养基中，在 25和光照强度 15003000lx 条件下，培养 15 20d 可长出新根。对每株生根苗进行编号。 热处理结合茎尖培养脱毒热处理方法将待脱毒的菊花植株放入光照培养箱中，采用变温升温的方式进行热处理，在日温/夜温分别为26/20下培养 2d，而后每两天昼/夜温度分别升高 2，直至 38/30，该温度下培养 40 d。光照时间 16 h/天，光强为 2000 lx。剥取热处理过程长出的新梢顶端 0.30.5mm 的茎尖进行组织培养。 热处理茎尖培养脱毒按照 4.1 茎尖培养脱毒方法进行培养，分化出苗、转接生根，对每株生根苗进行编号。 病毒检测主要病毒种类菊 花 B 病 毒 Chry

7、santhemum virus B （CVB) 番 茄 不 孕 病 毒 Tomato aspermy virus （TAV) 番 茄 斑 萎 病 毒 Tomato spotted wilt virus （TSWV) 黄 瓜 花 叶 病 毒 Cucumber mosaic cucumovirus （CMV) 菊 花 矮 化 类 病 毒 Chrysanthemum stunt viroid （CSVd) 菊花萎黄斑驳类病毒 Chrysanthemum chlorotic mottle viroid (CChmvd)。 检测病毒，见附录A。取 23cm 高的植株叶片组织作为检测样品，确认不带病毒的材

8、料为脱毒原种苗，用于进一步繁殖。 脱毒原种苗的保存、扩繁与炼苗移栽脱毒原种苗保存将脱毒原种试管苗转接到 MS 琼脂培养基上，置于 2025的光照培养室中保存， 2030d 继代转接一次，继代次数控制在 1015 代。 脱毒原种苗的扩繁调节增殖培养基中细胞分裂素和生长素浓度的比例，使增殖比控制在 2.53.5 倍之间。切取增殖后的组培不定芽，转接至生根培养基中进行生根培养。 脱毒原种苗的炼苗移栽瓶苗株高 67cm，56 平展片，具 5 条以上 34cm 长的根时即可炼苗。炼苗以泥炭：珍珠岩（1:1, V/V）为基质，铺于苗床或穴盘内。将组培生根苗至于光亮处锻炼 23 天，将其从组培瓶中取出，洗去

9、根部附着的培养基，然后种植于上述苗床或穴盘内，2030 天后，每周浇 1/4 至 1/8 浓度的 MS 营养液以促进生长。温度控制在 1525。 脱毒原种苗的生物性状观察随机抽取每个无性系脱毒苗 510 株，与其母株一并种植至开花。观察比较其主要生物性状，与母株无差异者则可确认为原种苗，有差异则淘汰整个无性系。脱毒原种苗的繁殖组织培养繁殖按照 3.4.2 脱毒苗扩繁的方法进行。 扦插繁殖参照DB32/T 1530-2009 中的 7、8、9 执行。 建立脱毒苗母本圃保护地栽培，在防虫温室内作苗床栽培或地栽。土壤或基质须经蒸汽或药剂消毒，定植前施颗粒有机肥（1kg/m2），pH 值 67，电导率

10、 0.81.2。 脱毒种苗的质量检测脱毒种苗的质量检测参照 NY/T 1591-2008 中 5.1.3 进行抽样检查，并按照 NY/T 1591-2008 中 5.2 的内容进行检测，确定种苗的质量等级。 包装与贮运包装种苗袋选用材质为 0.050.08mm 的透明塑料薄膜，大小为 35cm35cm，袋上打 1216 个直径 5mm 的透气孔。每袋装种苗 50100 株，袋装时须将带基质的根部朝下，茎叶部朝上，整齐排列，然后装入专用种苗箱。包装箱材质应为双瓦楞纸箱，种苗箱应有良好的承载能力和耐湿性，宽 40cm，长 60cm，高 20cm22cm，两侧留有透气孔。装箱时种苗袋应直立排放，每箱

11、放置 5001000 株。装箱后用胶带封好箱口。 包装标识包装箱(图 1)上应有明显标识，内容包括：产品名称、质量等级、包装容量、生产单位、产地、采收包装日期，若需冷藏保存，应注明冷藏温度。标识内容要求字迹清晰、完整、规范。 图 1 种苗包装箱贮运可在 25冷库中贮存，贮存时间不超过 7d。种苗运输时间超过 3d 时，则应采用控温 46的冷藏车。 附 录 A（规范性附录）RNA 病毒的反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）检测法设备和材料枪头、离心管和PCR 管均需经高温消毒。A.1.1 微量移液器：2001000L、20200L、10100L、0.510L、0.52.5L、01.0L。电子天平

12、：精度为 0.01g。高速冷冻离心机。PCR 仪。水平凝胶电泳系统。凝胶成像系统。药品和试剂所用试剂为分析纯，水为灭菌的双蒸水。A.2.1 RNA 提取试剂 Trizol，氯仿，异丙醇，70%乙醇，DEPC 水，双蒸水。 A.2.2 反转录试剂 M-MLV 反转录酶，5M-MLV 缓冲液，核糖核酸酶抑制剂，随机引物，10mmol/LdNTP。-20贮藏。A.2.3PCR 试剂 TaqDNA 聚合酶，10Buffer，PCR 引物（上游，下游）。A.2.4 5TBE 缓冲液 A.2.5 加样缓冲液 0.25%溴酚蓝溶解于 40%（W/V）蔗糖水溶液，4保存。 操作步骤菊花总RNA的提取菊花总 R

13、NA 的提取按照 TaKaRa 公司提供的 Trizol 试剂盒说明书进行，具体步骤包括：取菊花叶片 l00mg，用液氮研磨，加入 1mL 的 RNA 提取液，混合均匀，于冰上静置 5 min。4，12000 g 高速离心 10 min，吸取上层溶液转移到新的 1.5 mL 的 EP 离心管中。向离心管中加入 1/5 体积的氯仿溶液，振荡，混合均匀，于室温下静置 5min。4，12000 g 高速离心 15 min，吸取上层溶液转移到新的 1.5 mL EP 离心管中。重复步骤(3)、(4)两次。向 1.5mL EP 管中加入等体积的异丙醇(预冷)，摇匀，室温下静置 10 min。4，1200

14、0g 高速离心 l0min，弃上清。用 1mL75%的乙醇洗涤 23 次，12000g 高速离心 10 min，弃上清，于超净工作台上通风干燥RNA，并加入 30 L 的无RNase 的DEPC 水溶解。取 2L 的RNA 加 58L 的DEPC 水稀释，用核酸定量仪在 260/280nm 测量RNA 的浓度及纯度。取 2L 的 RNA 溶液，用 1%的琼脂糖凝胶电泳检测 RNA 的质量，其余的 RNA 放置于-80 保存备用。第一链 cDNA 合成cDNA 合成参照试剂盒(M-MLV RTase cDNA Synthesis Kit, TaKaRa)，具体步骤如下：在离心管中配制下列混合液:

15、Total RNA (10pg-5g)1LRadom Primer (25 M)1LRNase Free dH2O4L-70保温 10 min 后，迅速在冰上放置 2 min 以上。离心数秒，使模板RNA/引物变性溶液聚集于离心管底部。在上述 Microtube 管中配置下列反转录反应液： 上述模板RNA/引物变性溶液6L5M -MLV Buffer2LdNTPs Mixture (10 mM each)0.5LRNase Inhibitor (40 U/nl)0.25L RTase M-MLV (RHase H-) (200 U/L)0.4LRNase Free dH2O0.85L30保温

16、10min。42延伸 1 h。70保温 15 min 后冰上冷却，得到的 cDNA 直接用于PCR 扩增，也可置于-20保存。PCR 扩增及电泳在 Microtube 管中配制下列混合液:10PCR Buffer2.5LMg2+1.5LdNTP(2.5 mM each)2.0L上游引物(20M)1.0L下游引物(20M)1.0LcDNA1.0LrTaq (5U/L)0.2LddH2Oadd to 25LPCR 反应程序：94预变性 5min；94变性 45s，按照不同病毒退火温度不同，72延伸 1min， 35 个循环；72延伸 7min；4保温。电泳：配制 1%-1.75%(W/V)的琼脂糖

17、凝胶；放入电泳槽中，电泳液浸没胶面 1 mm。样品中加入等体积的上样缓冲液，混匀；沿着胶孔边缘匀速加入。接通电源，选择合适的电压和时间电泳。电泳结束后，胶块置于紫外成像系统中，调整拍摄范围和焦距，拍摄成像。结果判断阳性对照有目标带出现，阴性对照无带时，检测的效果为有效。检测样品有与阳性对照相同的目标带出现时为阳性，无目标带为阴性。 表 1菊花病毒的特异性引物病毒名称引物序列（5-3）退火温度产物（bp）菊花 B 病毒（CVB）P1：ACCGAATTCTTAGTCACAATGCCTCCCP2：TCCGAGCTCATAGAGACGGCATACCTT55650番茄不孕病毒（TAV）P1：CCATCCCTTCAACATCCGACTTP2：GGAGCGTTGAAGCGGAAGGAAT52499番