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文档简介

1、结核分枝杆菌荧光定量检测试剂盒研发步骤非竞争性内标法模板的获得(TB标品和内标DNA)(1) 普通PCR反应选用一种工作标准品为模板,根据巨细胞病毒荧光定量检测试剂盒说明书进行普通PCR反应,反应后溶液进行琼脂糖凝胶电泳,并对目的条带进行切胶回收。(2) 连接由于Taq酶的PCR反应产物末端带A,故直接以上述切胶回收的PCR片段为目的PCR片段,按pGMT克隆试剂盒进行10l连接体系的配制,4过夜连接。(3) 转化10l昨日过夜连接的体系转入50l TP10感受态细胞中,冰浴30min,42 90s热激,冰浴2-3min,加入600l LB培养基后37震荡培养90min。分别涂100l于现倒的

2、蓝白筛选平板,37过夜培养。(4) 检测挑取白色菌落接种于1-5ml LB培养基中,摇到一定浓度后,以菌液为模板用普通PCR进行验证。(5) 测序选择条带正确的菌液进行测序。基因的查找和比对(TB标品和内标DNA)从/网点的genbank中下载所需要的序列,与测序结果进行比对。由于不知道测序基因的具体名称,故需要进行大量的比对以找出其在genebank中的序列。TB标品DNA序列:CACATCAGCCGCGTCCACGCCGCCAACTACGGTGTTTACGGTGCCCGCAAAGTGTGGCTAACCCTGAACCGTGAGGGCATCGAGGTGGCCAGATGCACCGTCGAACGG

3、CTGATGACCAAACTCGGCCTGTCCGGGACCACCCGCGGCAAAGCCCGCAGGACCATB内标DNA序列:CACATCAGCCGCGTCCACATCTGATCCGTAGCGACTACGGACGCGCGCCTACGCCCTTCTCAGTTAA引物和探针的设计(TB标品和内标DNA)(1) 引物设计引物序列:上游引物TB-F: 5 CACATCAGCCGCGTCCACG 3 19bp下游引物TB-R: 5 TGGTCCTGCGGGCTTTGC 3 18bp内标引物:上游引物TBN-F: 5 ACATCAGCCGCGTCCAC 3 17bp下游引物TBN-R: 5 AACTG

4、AGAAGGGCGTAGGC 3 19bp(2) Taqman探针设计TB标品DNA探针(第一通道): 5 端荧光报告集团FAM3 端荧光淬灭基团TAMRATB标品探针 FAM-AGGTGGCCAGATGCACCGTCGAACG-TAMRA TM=74TB内标DNA探针(第二通道):5 端荧光报告集团HEX3 端荧光淬灭基团BHQ1TB内标探针 HEX-CTGATCCGTAGCGACTACGGACGCG-BHQ1 TM=73实时荧光定量PCR实验体系的优化(1) 引物退火温度引物的一个重要参数是熔解温度(Tm)。这是当50的引物和互补序列表现为双链DNA分子时的温度。Tm对于设定PCR退火温度

5、是必需的。在理想状态下,退火温度足够低,以保证引物同目的序列有效退火,同时还要足够高,以减少非特异性结合。合理的退火温度从55到70。退火温度一般设定比引物的Tm低5。所有oligo软件会自动计算引物的Tm值。在设置退火温度时可以如下进行:以低于估算的Tm5作为起始的退火温度,进行温度梯度PCR,找到引物的最佳退火温度。找到引物的最佳退火温度:58.8(2) 引物浓度引物的浓度会影响特异性。最佳的引物浓度一般在0.1到0.5M。较高的引物浓度会导致非特异性产物扩增。将引物的终浓度分别设置为几个梯度,使用RT-PCR进行扩增,从扩增曲线质量上选取最佳的引物浓度。(3) 探针浓度由于反复冻融易导致

6、探针降解,在确认探针质量好的情况下,最好稀释成2M(10),作为工作浓度分装多支,避光保存。将探针的终浓度设置为200 nM左右的几个梯度,使用RT-PCR进行扩增,从扩增曲线质量上及电泳图谱选取最佳的引物浓度。如果荧光信号强度不足,可以增加至0.4uM。(4) 镁离子浓度镁离子影响PCR的多个方面,如DNA聚合酶的活性,这会影响产量;再如引物退火,这会影响特异性。dNTP和模板同镁离子结合,降低了酶活性所需要的游离镁离子的量。最佳的镁离子浓度对于不同的引物对和模板都不同,但是包含200M dNTP的实时定量PCR,使用3到5mM带有荧光探针的镁离子溶液(普通PCR是1.5mM)。较高的游离镁

7、离子浓度可以增加产量,但也会增加非特异性扩增,降低忠实性。为了确定最佳浓度,普通PCR从1mM到3mM,以0.5mM递增,进行镁离子滴定。(6) dNTPs浓度将探针的终浓度设置为0.2mM左右的几个梯度,使用RT-PCR进行扩增,从扩增曲线质量及电泳图谱上选取最佳的dNTPs浓度。(7) 模板浓度对模板做一个梯度稀释的实验。此外,每个引物都要设无模板对照,阳性对照以及污染对照。最佳反应体系及配比(50l):稀释105的TB标品DNA:1l稀释105倍的TB内标DNA:0.25lTB-F(10M):0.5lTB-R(10M):0.5lTBN-F(10M):0.5lTBN-R(10M):0.5lTB标品-Probe(10M):1lTB内标-Probe(10M):1ldNTPs(2.5mM):0.8lMgCl2(25mM):0.3l10*Buffer(天根HotMaster):5l天根HotMaster Taq Polymerase:0.4lddH2O:39.5l反应程序:95 5min;95 20s,60 1min,40Cycles试剂盒检测所需条件的测定(1) 特异性实验对不同的质粒和cDNA样品进行RT-PCR反应,每个样品3个重复,观察该试剂盒的特异性。(2) 灵敏度实验

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