蛋白质组学的样品制备

1、Word文档 蛋白质组学的样品制备 想要讨论蛋白质，首先要得到高度纯化且具有生物活性的目的物质，因此，蛋白样品的制备是重要前提。蛋白提取的质量和效果对后续的讨论分析有重要影响。不同种类的样本在制备过程中，存在一些差异，要依据样本特征调整试验方案和操作细节。 基本原则样品处理尽量简洁，削减蛋白损失；尽量避开蛋白的降解；尽可能提高样品蛋白的溶解度；防止溶液介质中对蛋白质的人为修饰；去除非蛋白杂质。制备过程蛋白质的制备一般要经过以下四个阶段：选择材料和预处理，材料的破裂，提取和纯化，浓缩、干燥和保存。由于蛋白种类繁多，性质差异较大，因此不行能有一个固定的程序适用各类蛋白质的分别。依据性质进行分类，大

2、部分蛋白质均可溶于水、稀盐、稀酸或稀碱溶液中，少数与脂类结合的蛋白质溶于乙醇、丙酮及丁醇等有机溶剂中。因此可采纳不同溶剂提取、分别及纯化蛋白质。制备原理蛋白质在不同溶剂中溶解度的差异，主要取决于蛋白分子中非极性疏水基团与极性亲水基团的比例，其次取决于这些基团的排列和偶极矩。故分子结构性质是不同蛋白质溶解差异的内因。温度、 pH、离子强度等是影响蛋白质溶解度的外界条件。温度：多数蛋白质的溶解度随着温度的上升而增大，因此，温度高利于溶解，缩短提取时间。但另一方面，温度上升会使蛋白质变性失活，因此，基于这一点考虑提取蛋白质和酶时一般采纳低温（5度以下）操作。pH：蛋白质，酶是具有等电点的两性电解质，

3、提取液的 pH值应选择在偏离等电点两侧的 pH 范围内。用稀酸或稀碱提取时，应防止过酸或过碱而引起蛋白质可解离基团发生变化，从而导致蛋白质构象的不行逆变化，一般来说，碱性蛋白质用偏酸性的提取液提取，而酸性蛋白质用偏碱性的提取液。离子强度：稀浓度可促进蛋白质的溶，称为盐溶作用。同时稀盐溶液因盐离子与蛋白质部分结合，具有爱护蛋白质不易变性的优点，因此在提取液中加入少量 NaCl 等中性盐，一般以 0.15 摩尔。升浓度为宜。缓冲液常采纳 0.02-0.05M 磷酸盐和碳酸盐等渗盐溶液。提取蛋白质时常依据这些内外因素综合加以利用，将细胞内蛋白质提取出来，并与其它不需要的物质分开。制备方法破裂的方法有

4、很多种，可归纳为：机械法（超声波法、机械匀浆法、液氮研磨法和玻璃珠破裂法），化学法（去污剂法、酶裂解法、），物理法（循环冻融法、渗透法、高压法）。这些方法有不同的应用范围，基本的原则都是要以最小的限度削减蛋白水解和其它形式的蛋白降解变性，这也就是在样品制备破裂这一步的关键所在。而常用的方法有：超声波法、机械匀浆法、液氮研磨法、盐析、沉淀法。其中，有机溶剂沉淀法使用较为普遍，常用的有机溶剂有丙酮、苯/酚等。冷丙酮沉淀丙酮和苯/酚沉淀法留意事项：1.冷丙酮沉淀的时间与温度。常温或升温时，蛋白立体结构绽开，丙酮极简单与其中的色/氨酸、酪/氨酸等氨基酸进行疏水结舍导致蛋白变性，所以我们通常预冷丙酮并且

5、低温操作。2.超声功率和时间，重在观看超声后样品溶性的匀称度。3.一般和三氯/乙酸一起使用，效果更好。4.还原烷基化。苯/酚提取1.各种试剂的正确及精确配制。（如：煎糖提取液）2.加入饱和酚后要充分震荡和离心。（使蛋白充分与酚、色素H键结合，让其分三层）3.需纯化蛋白。（甲醇、TCA/冷丙酮去色素、苯/酚等杂质）留意事项1.在蛋白质制备过程中使组织始终置于冰上，离心机、离心管等仪器设备要提前预冷，以防蛋白质的降解。2. 要加入适量的裂解液，裂解肯定要充分，匀称。3. 植物和动物组织样本一般采纳研磨或匀浆机破裂处理，细胞和菌体样本一般采纳超声破裂，破裂过程中要避开材料的溶化。4. 对预处理好的材料，若