-北京林业大学植物组织培养思考题答案

1、思考题 1外植体： 由活体（ivivo)植物体上提取下来的，接种在人工培养基上的无菌细胞、组织、器官等。组织培养：将离体(invitro)的植物器官、组织、或细胞,在无菌条件下,利用人工培养基培养、生长、发育再生出完整植株的过程。培养基：能满足植物细胞生存、增殖、再生所需要的营养物质。主要包括大量/微量无机元素、维生素、氨基酸、糖类、植物生长调节物质（如激素）、固化物、水等愈伤组织：在人工培养的外植体上形成的一团无序生长状态的薄壁细胞细胞全能性：植物细胞具有该植物体全部的遗传信息，在一定的营养物质、激素和其他外界条件的作用下，具有发育成完整植物体的潜在能力。生物体的每一个细胞都包含有该物种所特

2、有的全套遗传物质，从理论上讲，都有发育成为完整个体的可能性。分化细胞：具有特定的形态、结构、功能的细胞脱分化：将已分化的、已停止分裂的组织细胞从植物体的抑制性影响下解脱出来，恢复细胞的分裂、分化活性人工种子：植物组织培养产生与正常合子胚相似的胚状体(embryoid)，将胚状体包裹在含有养分和具有保护功能的包膜中，并在适宜条件下能够发芽出苗，称为植物人工种子(plant artificial seeds)灭菌：指用物理或化学的方法，杀死物体表面和孔隙内的一切微生物或生物体，即把所有生命的物质全部杀死无菌操作：通过严格灭菌的操作空间(接种室、超净台、等)和使用的器皿，以及操作者的衣着和手都不带任

3、何活着的微生物，称为无菌操作消毒：指杀死、消除或充分抑制部分微生物，使之不再发生危害作用。显然经过消毒，许多细菌芽孢、霉菌的厚垣孢子等不会完全杀死，即由于在消毒后的环境里和物品上还有活着的微生物。接种：表面灭菌处理后的植物材料，经切割分离出器官、组织、细胞，再经无菌操作转接到无菌培养基上的过程，称接种褐变：在培养过程中，外植体表面颜色逐渐变褐，进而整个培养基褐变的现象。玻璃化现象：在长期的离体培养过程中，试管苗生长异常，表现为试管苗叶、嫩梢呈水晶透明或半透时， 水浸状；整株矮小肿胀、失绿；叶片皱缩成纵向卷曲、脆弱易碎；叶表缺少角质层蜡质，没有功能性气孔，不具有栅栏组织，仅有海绵组织初代培养：接

4、种某种外植体后，最初的几代培养。继代培养：继初代培养之后，营养物质枯竭，水分散失，代谢产物的积累，必须转移外植体到新鲜培养基上培养。定芽：在高等植物正常的个体发育中，一般从茎尖或叶腋等一定位置生出芽，如顶芽、腋芽、副芽等，称为定芽不定芽：从叶、根、或茎节间等通常不形成芽的部位生出的芽，称为不定芽胚状体: 由愈伤组织类似薄壁组织细胞不经有性过程而直接产生类似胚的结构，称为胚状体.驯化：通过减肥、增光、降温、控水等措施，提高试管苗对外界环境条件的适应性，提高光合作用的能力，提高试管苗的移栽成活率。指示植物：有些植物对病毒极为敏感，感染后会在其叶片乃至全株上表现特殊的病斑脱毒苗：指经过茎尖嫁接或热处

5、理茎尖嫁接后,再采用科学的方法鉴定确诊已不带上述病毒或类似病毒的苗木为母本,然后采用无病毒繁殖程序培育出来的苗木思考题 2植物组织培养特点培养条件可以人为控制，成活率高组织培养采用的植物材料在人为提供的培养基质和小气候环境条件下进行生长摆脱了大自然中四季、昼夜的变化以及灾害性气候的不利影响，条件均一，对植物生长极为有利，便于稳定地进行周期性培养生产。生长周期短，繁殖率高根据不同植物不同部位的不同要求提供不同的培养条件，因此生长较快，20-30d 即为一个周期。植物材料按几何级数繁殖生产植物组织培养需要一定设备及能源消耗，但总体来说成本低廉，能及时提供规格一致的优质种苗或脱病毒种苗。管理方便，利

6、于工厂化生产和自动化控制植物组织培养通过人为提供一定生长条件，既利于高度集约化和高密度工厂化生产，也利于自动化控制生产，是未来农业工厂化育苗的发展方向。与盆栽、田间栽培等相比省去了中耕、除草、浇水施肥、防治病虫害等一系列繁杂劳动，大大节省人力、物力及田间种植所需要的土地。不同细胞潜在全能性（或再生成新个体的能力）的差异受精卵的全能性最高体细胞的全能性比分化细胞的高分生组织细胞的全能性比分化细胞的高植物细胞的全能性高于动物细胞植物组织培养在生产上的应用快速繁殖短期内获得大量遗传性一致的植株。已成为优良品种种苗生产的主要技术之一 从优良母株上去下一小块组织，一年可以繁殖几万到几百万个植株。在花卉育

7、种过程中，不断的杂交、选种扩展了花卉的花形与颜色，但也造成了花卉基因类型的高度异质化，子代不易有均一表现。组培苗是在母株器官、组织或细胞的基础上发展起来的，可以保持母株的全部特性目前，用组织培养进行工厂化育苗已广泛用于生产专家们预测，到二十一世纪中期，果树、经济林木、名贵花卉、药材等苗木将主要通过组织培养来繁殖。种苗脱毒应用营养繁殖(块茎、扦插等）的植物，其病毒病危害相当严重。-病毒通过营养体及其刀具、土壤传递，大大加速了病毒病的传播和积累。据统计，观赏植物的病毒已多达 100 多种。-花少且小、花朵畸形，变色，大大影响观赏价值，严重者甚至导致品种的灭绝。 植物组织培养脱毒的原理：茎尖分生组织

8、不带毒或带毒少。-感病植株体内的病毒分布不均匀，其数量随植株部位和年龄而异，越靠近茎尖顶端的区域，病毒的浓度也越低。-分生区域无维管束，病毒只能通过胞间连丝传递，其传递速度低于细胞分裂和生长的速度。通过组织培养可以有效地培育出大量的无病毒种苗。已取得成功的有草莓、马铃薯、香蕉、生姜等。新品种培育植物细胞或原生质体经愈伤组织诱导再生植株的过程中，可能伴随着广泛的变异，又称为体细胞无性系变异。植物体细胞无性系变异是遗传变异的重要来源之一，具有变异广泛、后代较稳定、基本保持原品种特性等优点。细胞在离体培养过程中会产生广泛的无性系变异，通过协迫培养，可以获得具有相应耐性的愈伤组织，诱导再生获得耐性植株

9、。-采用组织培养诱变和筛选具抗病、抗盐、高赖氨酸、高蛋白等优良性状的品种。-中国林科院用逐步加大培养基中盐的浓度，直接获得耐盐的杨树株系。远缘杂交种后代的获得：百合、鸢尾等许多花卉虽然可以进行远缘杂交，但是由于生理代谢等方面的原因，常使杂种胚早期败育，因而得不到杂种植物。而通过胚培养，可使其顺利生长，得到远缘杂种。-辽宁果树研究所利用这种方法获得苹果与梨的杂交种。物理、化学诱变处理获得人工突变体秋水仙素诱导多倍体-以四季桔种子为外植体, 秋水仙素诱导多倍体 变异植株，叶片变大,茎变粗, 气孔明显增大，气孔密度降低.-花卉茎秋水仙素处理，新品种植株粗壮、叶大、花器官增大、花色更娇艳，如百合、萱草

10、、金鱼草、马蹄莲、报春花转基因植物基因工程体系中，基因转导后必须通过组织培养途径才能实现植株再生。 基因工程包括互相衔接的三个部分：-目的基因的分离、体外重组；-将外源基因引入受体细胞并使其转化和植株再生；-鉴定转基因植物表型种植资源保存-有性繁殖会造成不同程度的基因重组和变异，如红色可能变异成粉红色等；组织培养可保持原母本的一切遗传特性，防止种质资源的退化。-频危品种：增加频危品种的数目（熊猫）-无性繁殖的植物无法通过种子繁殖和长期保存，其种质资源只能靠田间种植保存，耗费人力物力， 且资源易受人为因素和环境因素影响。用组培方法，可大大节省人力、物力，延长保存期。-人工种子：植物组织培养产生与

11、正常合子胚相似的胚状体(embryoid)，将胚状体包裹在含有养分和具有保护功能的包膜中，并在适宜条件下能够发芽出苗，称为植物人工种子(plant artificial seeds)1977 年，Murashige 第一次提出人工种子构想。把胚状体包埋在胶囊内形成球状结构，使其具有种子的机能并可直接播种于田间次生代谢产物具有某种合成特殊物质能力的植物细胞，通过组织培养获得生物制品。-已在 400 多种药用植物中建立了组织和细胞培养物，从中分离出 600 多种代谢产物，包括利用细胞培养物中获得的有用物质制成的药品、营养品、饮料、香烟、化妆品等商品已投放市场红豆杉：紫杉醇，抗癌首选药物，每升细胞培

12、养物中紫杉醇的产量可达 0.25mg。鸭脚树种子：利血平，降血压，愈伤组织。人参根：人参皂苷，保健品利用组培技术获得次生代谢产物的特点：次生代谢产物是在完全人工控制的条件下生产的，不受地区和季节限制，节约土地，便于工业化生产。通过选择优良品系和改变培养条件，可得到超越原植物产量的代谢物-高效率。-对新疆紫草进行细胞培养，获得了比原植株含量高 6 倍的紫草素。对有效成分的合成路线进行遗传操作，大规模生产我们所需的有效次生代谢产物。-对毛花洋地黄品系进行组织培养，在培养液中加入生物合成途径的中间化合物毛地黄毒素和一甲基毛地黄毒素，能使毛地黄毒苷或其 6甲基衍生物在 C12 位置羟基化而转化成更有医

13、药价值的强心剂地高辛或 6甲基地高辛，转化速率几乎 100 。植物组织培养脱毒的原理和意义植物组织培养脱毒的原理：茎尖分生组织不带毒或带毒少。-感病植株体内的病毒分布不均匀，其数量随植株部位和年龄而异，越靠近茎尖顶端的区域，病毒的浓度也越低。-分生区域无维管束，病毒只能通过胞间连丝传递，其传递速度低于细胞分裂和生长的速度。 无病毒苗培育的意义用组织培养方法生产无毒苗，是一个积极有效的途径，排除了使用药剂，减少污染、防止公害、保护环境。无病毒苗可以表现出明显的优良效果。-草莓可增产 20%50%，植株结果多，单果重增加，上等果比例提高。-菊花切花品种的脱毒株，表现出株高增加，切花数增多，花朵大，

14、切花较重等特点。-日本用柑桔茎尖微嫁接繁殖无病毒柑桔营养系；美国用组织培养法，使苹果无病毒苗已工厂化育苗。植物组织培养中需要的环境条件如温度、光照、湿度等（我猜这个考填空）在植物组织培养中温度、光照、湿度等各种环境条件，培养基组成、pH 值、渗透压等各种化学条件都会影响组织培养育苗的生长和发育。温度(temperature)温度不仅影响植物组织培养育苗的生长速度，也影响其分化增殖以及器官建成等发育进程。如烟草芽的形成以 28最好，在 20以下，33以上形成率皆最低。大多数植物组织培养在 2327之间进行，一般采用 252。低于 15植物组织生长停止，高于 35 对植物生长不利。-不同植物培养的

15、适温不同，百合的最适温度是 20、月季足 25-27、番茄是 28。-桃胚在 2-5条件进行一定时间的低温处理，有利于提高胚培养成活率。用 35处理草莓的茎尖分生组织 3-5d，可得到无病毒苗。光照(light)主要涉及光强、光质、以及光照时间方面光照强度(light intensity)光照强度对培养细胞的增殖和器官的分化有重要影响，特别对外植体细胞的最初分裂有明显的影响。 光照强度强，幼苗生长粗壮；而光照强度较弱，幼苗容易徒长。光质(light wave)光质对愈伤组织诱导、培养组织的增殖以及器官的分化都有明显的影响。-百合珠芽在红光下培养 2 周后，分化出愈伤组织。但在蓝光下培养几周后，

16、才出现愈伤组织，-唐菖蒲子球块接种 15d 后，在蓝光下培养首先出现芽，形成的幼苗生长旺盛，而白光下幼苗纤细光周期(light period)试管苗培养时要选用一定的光暗周期，最常用的周期是 16h 的光照，8h 的黑暗。-对短日照敏感品种的器官组织，在短日照下易分化，而在长日照下产生愈伤组织，如红花、乌饭树。 湿度 (humidity)-容器内湿度主要受培养基水分含量和封口材料的影响。在冬季应适当减少琼脂用量，培养基干硬不利于外植体接触或插进培养基，导致生长发育受阻。封口材料直接影响容器内湿度情况，封闭性较高的封口材料易引起透气性受阻，会导致植物生长发育受影响。-环境的相对湿度湿度过低会使培

17、养基丧失大量水分，导致培养基各种成分浓度的改变和渗透压的升高，影响组织培养的正常进行。湿度过高时，易引起棉塞长霉，造成污染一般要求相对湿度 70%80%，常用加湿器或洒水的方法来调节。渗透压(penetrating pressure)培养基中含有盐类、蔗糖等化合物，其浓度、含量变化能影响渗透压的变化。1-2 个大气压对植物生长有促进作用，2 个大气压以上对植物生长有阻碍作用，5-6 个大气压使植物生长完全停止，6 个大气压以上植物细胞不能生存。pH 值 (pH value)不同植物对培养基最适 pH 值的要求不同，大多 5-6.5，一般 5.8。培养基的组成影响 pH 值。以硝态氮作氮源以铵态

18、氮作氮源当 pH 值高于 6.5 时，培养基变硬；低于 5 时，琼脂不能很好地凝固。高温灭菌会降低 pH 值(约 0.2-0.3 个 pH 值) 。可用 0.1M 的 NaOH 和 0.1M 的 HCI 调整 pH 值。氧气(oxygen)氧气是组织培养中必需的因素，瓶盖封闭时要考虑通气问题。棉塞封闭瓶口通气最好，但棉塞易使培养基干燥，夏季易引起污染;可用附有滤气膜的封口材料 固体培养基中加入活性炭可增加通气度，利于发根。培养室要经常换气，改善室内的通气状况。液体振荡培养时，要考虑振荡的次数、振幅等，同时要考虑容器的类型、培养基等生长素与细胞分裂素在组织培养过程中的作用和相互关系生长素类(au

19、xin)生长素主要用于愈伤组织诱导、根的分化和促进细胞分裂、伸长生长。-根对生长素最敏感，在极低的浓度下，(10-5-10-8ngL) 可促进生长，其次是茎和芽。-天然的生长素稳定性差，易被高温高压或光照破坏，在植物体内也易受到体内酶的分解。组织培养中常用人工合成的生长素类物质。IAA(indo acetic acid 吲哚乙酸) 天然存在，亦可人工合成，是生长素中活力最弱的，对器官形成的副作用小，易受高温、高压、光破坏，易被细胞中的 IAA 分解酶降解。NAA(naphthalene acetic acid 萘乙酸)启动组织培养的能力比 IAA 高出 3-4 倍，可人工合成，耐高温高压， 不

20、易被分解破坏，应用较普遍。广泛用于生根，与细胞分裂素互作促进芽的增殖和生长。IBA(indolebutyri acid 吲哚丁酸) 促进发根的生长调节物质。2,4-D(2,4-二氯苯氧乙酸)启动能力比 IAA 高 10 倍，特别促进愈伤组织的形成，但强烈抑制芽的形成，影响器官的发育。适宜的用量范围较狭窄，过量常有毒效应。细胞分裂素类 ( cytokinin )腺嘌吟的衍生物，包括 6-BA(6-苄基氨基嘌呤)、Kt (kinetin 激动素)、Zt (zeatin 玉米素)等。其中 Zt 活性最强，但非常昂贵，常用的是 6-BA。-在培养基中添加细胞分裂素有三个作用：诱导芽的分化，促进侧芽萌发

21、生长。促进细胞分裂与扩大。抑制根的分化。激素配比模式生长素与细胞分裂素的比例决定着发育的方向高：有利于根的形成和愈伤组织的形成适中：有利于根芽的分化低：有利于芽的形成生长素/细胞分裂素-使用浓度因植物的种类、部位、时期、内源激素等的不同而异，一般生长素浓度为 0.05-5mgL，细胞分裂素 0.05-10mgL。4) GA ( gibberellic acid 赤霉素)20 多种，生理活性及作用的种类、部位、效应等各有不同、培养基中添加的是 GA3。-赤霉素和生长素协同作用，影响形成层的分化。生长素赤霉素比值高时有利于木质部分化，比值低时有利于韧皮部分化；-赤霉素可用于打破休眠，促进种子、块茎

22、、鳞茎等提前萌发；促进幼苗茎的伸长生长，促进不定胚发育；在器官形成后添加赤霉素，可促进器官或胚状体的生长。比较固体培养和液体培养的优缺点固体与液体比较：优点：操作简便，便于经常观察研究等。缺点：培养物与培养基的接触（即吸收）面积小，各种养分在琼脂中扩散较慢，影响养分的充分利用；同时培养排除的一些代谢废物，聚集在吸收表面，对组织产生毒害作用。固体培养法：用琼脂固化培养基培养植物材料的最常用方法。该方法设备简单，易行，但养分分布不均，生长速度不均衡，并常有褐化中毒现象发生。液体培养法：用不加固化剂的液体培养基培养植物材料的方法。由于液体中氧气含量较少，所以通常需要通过搅动或振动培养液的方法以确保氧

23、气的供给，采用往复式摇床或旋转式摇床进行培养，其速度一般为50-100r/min。技能使培养基均一，又能保证氧气的供给。解释高压灭菌时排除锅内空气的原因和过程增压前，完全排除锅内空气，使锅内全部是水蒸气，灭菌才能彻底。-常用方法是：关闭放气阀，通电后，待压力上升到 O.05MPa 时，打开放气阀，放出空气，待压力表指针归零后，再关闭放气阀。关阀再通电后，压力表上升达到压力 0.1-0.15MPa，20min。灭菌的过程培养基的高压灭菌包括以下几个步骤：首先，往高压灭菌锅内（外层锅内加水），加水水位高度不超过支柱高度。其次，将分装好的培养基及所需灭菌的各种用具、蒸馏水等，放入高压灭菌锅的消毒桶内

24、，盖好锅盖，对称拧紧螺丝。第三，加热高压灭菌锅，打开放气阀，待煮沸排出冷空气后再关闭。第四，锅上压力表指针开始移动，当指针移至 1.11.2 kg/cm2，温度为 121时，维持该压力 20min 即可切断电源，待压力降为 0 后，才能打开锅盖。选择外植体应考虑哪些因素？1、 植物种质的选择：易于离体培养的品系；生产、研究上有重大意义的品系；考虑褐化问题。2、 外植体的大小：外植体的表面积、体积、细胞数量会影响培养效果。一般选择 1-2cm 左右大小。太大容易污染，太小不易启动或启动后仅产生愈伤组织。特殊组织器官按器官或组织单位切离 。3、外植体的年龄和着生部位：外植体的幼化程度直接影响组织培

25、养的结果。 来源于幼年植物的外植体比源于成年植株的外植体更易培养。较低部位外植体要比上部的外植体容易启动。4、取外植体的季节和时间：处于生长季节的外植体 更易培养。春季取材含菌数少，秋冬季取材难以成功。雨季、湿热季节取材难以成功。种质优良，植株健壮，取材的最适时期，适宜的大小外植体消毒的过程第一步，将采来的植物材料除去不用的部分，冲洗干净，把材料切割成适当大小。易漂浮或细小的材料，可装入纱布袋内冲洗。洗衣粉可除去轻度附着在植物表面的污物，除去脂质性的物质，便于灭菌液的直接接触；另外一种理想的清洗物质是表面活性物质Tween80第二步，在超净台或接种箱内，对材料的表面浸润灭菌。用 70%酒精浸

26、1030s。70%酒精具有浸润植物组织材料的作用，70%酒精具有较强的杀菌力 70%酒精穿透力强，易杀伤植物细胞，浸润时间不能过长。第三步，用灭菌剂处理。表面灭菌剂的种类较多，可根据情况选取。用灭菌剂处理后，需要用无菌水冲洗数次。 具体过程：把沥干的植物材料转放到烧杯或其他器皿中，记好时间，倒人消毒溶液，不时用玻璃棒轻轻搅动，以促进材料各部分与消毒溶液充分接触，使消毒彻底。在结束前 1-2min，把消毒液倾入一备好的大烧杯内，倾净后立即倒入无菌水，轻搅涮洗。灭菌时间是从倒入消毒液开始，至倒入无菌水时为止。在灭菌溶液中加吐温-80 或 Triton X 效果较好，这些表面活性剂主要作用是使药剂更

27、易于展布，更容易浸人到灭菌的材料表面。但吐温加入后对材料的伤害也在增加，应注意吐温的用量和灭菌时间，一般加入灭菌液的 O.5%。最后用无菌水涮洗，每次 3min 左右，视采用的消毒液种类，涮洗 3-l0 次左右，以免除消毒剂杀伤植物细胞的副作用。分析组织培养过程中影响褐变的因素植物品种：不同品种的褐变程度是不同的，主要在于多酚氧化酶活性上的差异，因此在培养过程中，应该对不同的品种分别进行处理。生理状态：由于外植体的生理状态不同，接种后褐变程度也有所不同。处于幼龄期的植物材料或幼嫩的组织褐变程度不明显，而从成年的植株或老熟的组织采收的外植体，含醌类物质较多，容易褐变。培养基成分：无机盐浓度过高，

28、会使某些观赏植物的褐变程度增加；细胞分裂素的水平过高会刺激某些外植体的多酚氧化酶的活性，从而使褐变现象加深。培养条件不当：光照过强、温度过高、培养时间过长等，均可使多酚氧化酶的活性提高，从而加速被培养的外植体的褐变程度。分析组织培养过程中玻璃化现象产生的原因在试管苗玻璃化过程中，作为内源激素的乙烯从代谢调节上起了关键性启动作用，乙烯的产生则取决于培养环境中的胁迫条件，如水势不当，通气不畅（造成缺氧）及培养基用 BA 量过高等；乙烯产生后引发了其他激素质和量上的改变及酶类的变化；因此发生蛋白质、纤维素和木质素的合成障碍及降解，叶绿素分解黄化，逐渐形成玻璃化症状琼脂和蔗糖浓度与玻璃化成负相关，琼脂或蔗糖浓度越高，玻璃苗的比率越低。培养基中 BA 浓度和培养温度与玻璃化成正相关，BA 浓度越高或培养温度越高，玻璃苗比率越大。培养瓶内气体与外界交换不畅。培养基中无机离子种类及比例不当：