3蔗糖酶蛋白含量测定及活力测定

1、专业：姓名：孙程珂学号：3150100531日期：地点：溯y乂学实验报告课程名称：生物化学实验（甲）指导老师：杨劲树成绩:同组学生姓名：二、实验内容和原理四、实验方法和步骤六、实验结果和分析一、实验目的和要求三、实验材料和主要仪器五、实验数据记录和处理七、实验讨论和心得一、实验目的和要求1、学习Folin-酚法测定蛋白质含量的原理和方法；2、掌握分光光度法制作标准曲线，准确测定未知样品的蛋白质含量；3、掌握分光光度计的使用方法。4、掌握酶活力测定的基本原理和方法；5、学习酶的比活力的计算。二、实验内容和原理Folin-酚测定法是在双缩脲反应的基础上发展起来的，Folin-酚试剂是由甲、乙两种试

2、剂组成的。甲试剂由碳酸钠、氢氧化钠、硫酸铜和酒石酸钾钠组成，在碱性条件下蛋白质中的肽键与酒石酸钾钠铜盐起作用，生成紫红色络合物；乙试剂是由磷钼酸和磷钨酸、硫酸、溴等组成，在碱性条件下，铜-蛋白质络合物以及蛋白质中的酪氨酸残基（酚基）和色氨酸还原磷钼酸-磷钨酸试剂（乙试剂）产生深蓝色（钼蓝和钨蓝的混合物），其色泽深浅与蛋白质含量成正比。可用500nm波长比色测定，适于测定蛋白质含量0.050.5g/L.优点：简单、迅速、灵敏度高；反应较稳定。缺点：该反应受多种因素的干扰。蔗糖酶（0-D-咲喃型果糖苷-果糖水解酶EC321.26），是一种水解酶。它能催化非还原性双糖（蔗糖）的1,2糖苷键裂解，将蔗

3、糖水解为等量的葡萄糖和果糖（还原糖）。因此，每水解1mol蔗糖，就能生成2mol还原糖。还原糖的测定有多种方法，例如：纳尔逊一索模吉（Nelson-Smogyi）试剂比色法，斐林试剂法等。本实验采用3.5二硝基水杨酸法测定还原糖的含量，由此可得出蔗糖酶水解速度。其原理是3.5二硝基水杨酸与还原糖共热被还原成棕红色的氨基化合物，在一定范围内还原糖的量和反应液的颜色深度成正比。因此可利用分光光度计在500nm进行比色测定，求得样品中的含糖量。此法操作简便、迅速、杂质干扰较小。蔗糖酶活力单位（u）:蔗糖酶在室温（50C）,pH4.5的条件下，每分钟水解产生1pmol葡萄糖所需的酶量（ml）。蔗糖酶比

4、活力的计算：酶的比活力一一为每毫克蛋白质所具有的酶活力单位数，一般用酶活力单位/mg蛋白质表示。酶的比活力在酶学研究中用来衡量酶的纯度，对于同一种酶来说，比活力越大，酶的纯度越高。利用比活力的大小可以用来比较酶制剂中单位质量蛋白质的催化能力，是表示酶的纯度高低的一个重要指标。比活力一一酶的总活力单位数除以总蛋白mg数，即每mg蛋白所含有的酶活力单位数。比活力=活力单位/mg蛋白P.2实验名称：姓名：学号:三、实验材料和主要仪器1、实验材料蔗糖酶提取的各步分离纯化样品I、II、III、IV。可根据样品溶液的蛋白质含量高低作适当的稀释。2、实验试剂（1）Folin-酚测定法：标准蛋白质溶液：0.5

5、g/L牛血清白蛋白Folin-酚试剂（甲试剂、乙试剂）（2）3,5-二硝基水杨酸比色法：lg/L葡萄糖标准溶液（葡萄糖相对分子量198.17）5%蔗糖溶液0.2mol/L乙酸缓冲液，pH4.53,5二硝基水杨酸试剂（DNS）3、实验器材与仪器（1）恒温水浴（50C、100C）；（2）可见光分光光度计、1cm玻璃比色皿；（3）试管、试管架；（4）移液管；（5）微量移液器：200p1、1000pl四、实验方法和步骤1、制备Folin-酚法蛋白质标准曲线试管号123456标准蛋白质含量（mg）00.10.20.30.40.50.5g/L标准蛋白质溶液（ml）00.20.40.60.81蒸馅水（ml）

6、10.80.60.40.20Folin-酚试剂甲(ml)555555混匀，在室温（25C）下静置10minFolin-酚试剂乙(ml)0.50.50.50.50.50.5混匀（加一管混一管），在室温（25C）下静置20min500nm00.1620.3300.4670.5800.695以光吸收值（A500）为纵坐标，标准蛋白质含量（mg）为横坐标，绘制蛋白质标准曲线。2、各步分离纯化的样品蛋白含量测定表2（4倍稀释：样品0.25ml+蒸馏水0.75ml）样品空白1（4倍稀释）口（4倍稀释）in（4倍稀释）IV（原阎编号12345678910111213样品液V（ml）0.00.050.20.5

7、0.050.20.50.050.20.50.050.20.5水(ml)1.00.950.80.50.950.80.50.950.80.50.950.80.5Folin酚甲试剂(ml)5.05.05.05.05.05.05.05.05.05.05.05.05.0混匀，室温（25P）放置lOminFolin酚乙试剂(ml)0.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.5混匀（加一管混一管）,室温（25P）放置20mineooim00.1901.0331.6700.2850.9441.5240.1010.5701.1390.0460.2660.554P.3实验名称：姓名

8、：学号:根据测得的光吸收值（A500），查蛋白质标准曲线得蔗糖酶蛋白含量，再进行样品I、II、III、IV溶液的最终蔗糖酶蛋白含量的计算。3、制备3,5-二硝基水杨酸法标准曲线1234567葡萄糖含量（umol）01.01.52.02.53.03.5lg/L葡萄糖标准溶液（ml）00.20.30.40.50.60.7H2O(ml)21.81.71.61.51.41.33.5-二硝基水杨酸（ml）1.01.01.01.01.01.01.0将各管溶液混匀后，在1009恒温水浴加热5min,取出立即用冷水冷却至室温蒸馅水（ml）7771771将各管溶液混匀A520mn00.1890.2910.563

9、0.7040.9391.068以葡萄糖含量（mg）为横坐标，A520值为纵坐标，制作葡萄糖浓度一吸光值标准曲线。4、各样品蔗糖酶的酶活力测定表4（200倍稀释：4倍稀释液0.02ml+蒸馏水0.98ml）样品空白I（200倍稀释）n（200倍稀释）111（2佛稀释）IV（50倍稀释）编号123456789101112130.2mol/L乙酸缓冲液(ml)0.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.5蒸馅水（ml）1.00.950.80.50.950.80-50.950.80.50.950.80.5蔗糖酶液（ml）0.00.050.20.50.050.20.50.

10、050.20.50.050.20.55%蔗糖溶液（ml）0.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.5保温时间立即混匀后，50X：保温lOmin3.5二硝基水杨酸翩（ml）1111111111111在100*C恒温水浴中加热5min蒸馅水1777717777777混匀52000.0380.2140.6550.0450.1170.6220.0580.2690.9970.0550.3961.065根据测得的光吸收值（A520），查标准曲线得蔗糖酶活力，再进行样品I、II、III、V溶液的最终蔗糖酶活力的计算。五、实验数据记录和处理1.数据：已记录在实验步骤的表格当中

11、2.处理：蛋白质标准曲线v=1.3903x+0.0248葡萄糖标准曲钱V=1.6218x-0.0893Rz=0.9923Ri=0.9732实验名称：姓名：学号:六、实验结果和分析1.经计算，可得总表如下体积(ml)蛋白浓度(mg/ml)总蛋白(mg)活力(u/ml)总活力u比活力u/mg样品I352.95103.2561.35214720.79样品II303.2296.651.02153115.85样品III9.59.7192.24588.5840.79.114样品V5.50.8054.427598.04539.2121.82分析：样品IV的比活力在数值上比其他样品大太多，原因可能是柱层析时收集蛋白液的时机没有把握好，使得蛋白含量较少；另一方面，可能是在测酶活力时稀释的时候所用的酶量过多，导致稀释造成的误差太大；当然，体积测量、分光光度测量的过程中均存在误差。由数据还是可以看出蛋白酶在一系列的纯化操作中不断的更纯，杂蛋白被逐步的去除。七、实验讨论和心得1加入Folin-酚试剂后，要迅速混匀(加一管混匀一管)，使还原反应产生在磷钼酸-磷钨酸被破坏之