十八章色谱法

1、十八章色谱法色谱法分类 1按两相状态分类 气体为流动相的色谱称为气相色谱GC，根据固定相是固体吸附剂还是固定液附着在惰性载体上的一薄层有机化合物液体，又可分为气固色谱GS C和气液色谱GLC液体为流动相的色谱称液相色谱LC。同理，液相色谱亦可分为液固色谱LSC和液液色谱LLC超临界流体为流动相的色谱称为超临界流体色谱SFC。随着色谱工作的开展，通过化学反响将固定液键合到载体外表，这种化学键合固定相的色谱又称化学键合相色谱CBPC。 2按别离机理分类 利用组分在吸附剂固定相上的吸附能力强弱不同而得以别离的方法，称为吸附色谱法。利用组分在固定液固定相中溶解度不同而到达别离的方法称为分配色谱法。利用

2、组分在离子交换剂固定相上的亲和力大小不同而到达别离的方法，称为离子交换色谱法。利用大小不同的分子在多孔固定相中的选择渗透而到达别离的方法，称为凝胶色谱法或尺寸排阻色谱法。最近，又有一种新别离技术，利用不同组分与固定相固定化分子的高专属性亲和力进展别离的技术称为亲和色谱法，常用于蛋白质的别离 3按固定相的外形分类 固定相装于柱内的色谱法，称为柱色谱。固定相呈平板状的色谱法，称为平板色谱，它又可分为薄层色谱和纸色谱。 根据以上所述，将色谱法的分类总结于表18-l中。18-2 色谱流出曲线及有关术语一流出曲线和色谱峰 如果进样量很小，浓度很低，在吸附等温线的线性范围内，色谱峰如果对称，可用Gauss

3、正态分布函数表示： 式中：C不同时间t时某物质的浓度，C0进样浓度，tr保存时间，标准偏差。二、基线 是柱中仅有流动相通过时，检测器响应讯号的记录值，即图183中Ot线稳定的基线应该是一条水平直线 三、峰高 色谱峰顶点与基线之间的垂直距离，以h表示，如图183中BA 四、保存值1死时间tM 不被固定相吸附或溶解的物质进入色谱柱时，从进样到出现峰极大值所需的时间称为死时间，如图18 3中 OA。因为这种物质不被固定相吸附或溶解，故其流动速度将与流动相的流动速度相近测定流动相平均线速时，可用往长L与tM的比值计算。 2保存时间tR 试样从进样开场到柱后出现峰极大点时所经历的时间，称为保存时间，如图

4、183 OB它相应于样品到达柱末端的检测器所需的时间 3调整保存时间tR 某组份的保存时间扣除死时间后称为该组份的调整保存时间，即 tR = tR-tM 由于组份在色谱柱中的保存时间tR包含了组份随流动相通过柱子所需的时间和组份在固定相中滞留所需的时间，所以tR实际上是组份在固定相中停留的总时间保存时间可用时间单位如s或距离单位如cm表示。 保存时间是色谱法定性的根本依据，但同一组份的保存时间常受到流动相流速的影响，因此色谱工作者有时用保存体积等参数进展定性检定 4死体积 VM 指色谱柱在填充后，柱管内固定相颗粒间所剩留的空间、色谱仪中管路和连接头间的空间以及检测器的空间的总和当后两项很小而可

5、忽略不计时，死体积可由死时间与流动相体积流速F0Lmin计算： VM = tMF0 5保存体积 VR 指从进样开场到被测组份在柱后出现浓度极大点时所通过的流动相体积。保存体积与保存时间t。的关系如下： VR = tRF0 6调整保存体积VR 某组份的保存体积扣除死体积后，称该组份的调整保存体积，即 VR = VR- VM 7相对保存值 某组份2的调整保存值与组份1的调整保存值之比，称为相对保存值： 由于相对保存值只与柱温及固定相的性质有关，而与柱径、柱长、填充情况及流动相流速无关，因此，它是色谱法中，特别是气相色谱法中，广泛使用的定性数据 必须注意，相对保存值绝对不是两个组份保存时间或保存体积

6、之比 .选择因子 在定性分析中，通常固定一个色谱峰作为标准s，然后再求其它峰i对这个峰的相对保存值此时，ri/s可能大于1，也可能小于1在多元混合物分析中，通常选择一对最难别离的物质对，将它们的相对保存值作为重要参数在这种特殊情况下，可用符号表示： 式中tR2为后出峰的调整保存时间，所以这时总是大于1的 。五、区域宽度 色谱峰的区域宽度是组份在色谱柱中谱带扩张的函数，它反映了色谱操作条件的动力学因素度量色谱峰区域宽度通常有三种方法： 1. 标准偏差 即0607倍峰高处色谱峰宽的一半，如图183中EF距离的一半。 2. 半峰宽W1/2 即峰高一半处对应的峰宽，如图183中GH间的距离它与标准偏差

7、的关系是： W1/2 3. 基线宽度W 即色谱峰两侧拐点上的切线在基线上的截距，如图183中IJ的距离它与标准偏差。的关系是： W = 4 从色谱流出曲线上，可以得到许多重要信息： l根据色谱峰的个数，可以判断样品中所合组 份的最少个数 2根据色谱峰的保存值(或位置，可以进展定性分析 (3) 根据色谱峰下的面积或峰高，可以进展定量分析 4色谱峰的保存值及其区域宽度，是评价色谱柱别离效能的依据 5色谱峰两峰间的距离，是评价固定相(和流动相)选择是否适宜的依据 183 色谱法分析的根本原理 色谱分析的目的是将样品中各组分彼此别离，组分要到达完全别离，两峰间的距离必须足够远，两峰间的距离是由组分在两

8、相间的分配系数决定的，即与色谱过程的热力学性质有关。但是两峰间虽有一定距离，如果每个峰都很宽，以致彼此重叠，还是不能分开。这些峰的宽或窄是由组分在色谱柱中传质和扩散行为决定的，即与色谱过程的动力学性质有关。因此，要从热力学和动力学两方面来研究色谱行为。 一、分配系数K和分配比k1分配系数K 如前所述，分配色谱的别离是基于样品组分在固定相和流动相之间反复屡次地分配过程，而吸附色谱的别离是基于反复屡次地吸附一脱附过程。这种别离过程经常用样品分子在两相间的分配来描述，而描述这种分配的参数称为分配系数见它是指在一定温度和压力下，组分在固定相和流动相之间分配达平衡时的浓度之比值，即 2.分配比k 分配比

9、又称容量因子，它是指在一定温度和压力下，组分在两相间分配达平衡时，分配在固定相和流动相中的质量比。即 k值越大，说明组分在固定相中的量越多，相当于柱的容量大，因此又称分配容量或容量因子。它是衡量色谱柱对被别离组分保存能力的重要参数。k值也决定于组分及固定相热力学性质。它不仅随柱温、柱压变化而变化，而且还与流动相及固定相的体积有关。 式中CS，Cm分别为组分在固定相和流动相的浓度； Vm为柱中流动相的体积，近似等于死体积。Vs为柱中固定相的体积，在各种不同的类型的色谱中有不同的含义。例如：在分配色谱中，Vs表示固定液的体积；在尺寸排阻色谱中，那么表示固定相的孔体积。滞留因子Rs 分配比k值可直接

10、从色谱图测得。设流动相在柱内的线速度为u，组分在柱内线速度为us，由于固定相对组分有保存作用，所以usu此两速度之比称为滞留因子Rs。 Rs假设用质量分数表示，即 对组分和流动相通过长度为L的色谱柱，其所需时间分别为整理式18-1418-17，可得 3. 分配系数K与分配比k的关系 其中称为相比率，它是反映各种色谱柱型特点的又一个参数。例如，对填充柱，其值一般为635；对毛细管柱，其值为60600。 4分配系数K及分配比k与 选择因子的关系 根据式18-9，18-21和18-22，对A、B两组分的选择因子，用下式表示 式18-23说明：通过选择因子把实验测量值k与热力学性质的分配系数K直接联系

11、起来，对固定相的选择具有实际意义。如果两组分的K或k值相等，那么=1，两个组分的色谱峰必将重合，说明分不开。两组分的K或k值相差越大，那么别离得越好。因此两组分具有不同的分配系数是色谱别离的先决条件。 二、塔板理论 最早由Martin等人提出塔板理论，把色谱柱比作一个精馏塔，沿用精馏塔中塔板的概念来描述组分在两相间的分配行为，同时引人理论塔板数作为衡量柱效率的指标。 该理论假定： i在柱内一小段长度H内，组分可以在两相间迅速到达平衡。这一小段柱长称为理论塔板高度H。 ii以气相色谱为例，载气进入色谱柱不是连续进展的，而是脉动式，每次进气为一个塔板体积Vm。 iii所有组分开场时存在于第0号塔板

12、上，而且试样沿轴纵向扩散可忽略。 iv分配系数在所有塔板上是常数，与组分在某一塔板上的量无关。 为简单起见，设色谱往由5块塔板n5，n为柱子的塔板数组成，并以r表示塔板编号，r=1，2，nl；某组分的分配比k=1. 根据上述假定，在色谱别离过程中，该组分的分布可计算如下： 开场时，假设有单位质量，即m=1例1mg或1g的该组分加到第0号塔板上，分配平衡后，由于k=1，即ns=nm故nm=ns=0.5。当一个板体积lV的载气以脉动形式进入0号板时，就将气相中含有nm局部组分的载气顶到1号板上，此时0号板液相或固相中ns局部组分及1号板气相中的nm局部组分，将各自在两相间重新分配。故0号板上所含组

13、分总量为05，其中气液或气固两相各为025而1号板上所含总量同样为05气液或气固相亦各为025。以后每当一个新的板体积载气以脉动式进入色谱柱时，上述过程就重复一次(见下表)。 按上述分配过程，对于n=5，k=1，m=1的体系，随着脉动进入柱中板体积载气的增加，组分分布在柱内任一板上的总量气液两相中的总质量见表：18-2由塔板理论可建流出曲线方程：m为组分质量，Vr为保存体积，n为理论塔板数。 当V=Vr 时，C值最大，即由流出曲线方程可推出： 而理论塔板高度H即： 从上两式可以看出，色谱峰W越小，n就越大，而H就越小，柱效能越高。因此，n和H是描述柱效能的指标。 通常填充色谱柱的n103，H1mm。而毛细管柱 n=105-106 由于死时tm包括在tr中,而实际的tm不参与柱内分配,所计算的n值尽大,H很小,但与实际柱效能相差甚远.所以,提出把tm扣除,采用有效理论塔板数neff和有效塔板高Heff评价柱效能。 塔板理论用热力学观点