病毒的分离培养与动物接种、鸡胚接种法

1、 病毒的分离培养与动物接种、鸡胚接种法 1练习内容 1小白鼠脑内接种法2小白鼠滴鼻感染法3鸡胚尿囊腔接种法 2目的要求 1了解病毒分离的方法2了解病毒接种的实验途径3掌握鸡胚尿囊腔接种的方法与尿囊液收获的方法 3病 毒 的 分 离 一、标本采取的原则 二、标本的处理 三、病毒的分离方法4一、标本采取的原则 1. 病毒标本的采取应尽早为好. 2.由于大多数病毒对热不稳定，应该立即接种，如果不能及时接种或需保存，一般置50甘油盐水4或一20以下保存。 5二、标本的处理（一）除菌处理 粪便可加青链霉素使最终浓度为10000单位/毫升，置4过夜。 鼻咽拭子一般加抗生素最终浓度为2000单位/毫升，置4

2、作用4小时。 对乙醚有抵抗的病毒如鼻病毒、肠道病毒、呼肠孤病毒、腺病毒、痘病毒等，则可加入等量的乙醚4过夜除菌。 6（二）研磨和稀释 对脑、脊髓等组织标本首先应经研磨器或乳钵中充分研磨后，加稀释液（PH7.6肉汤或10脱脂牛乳生理盐水或0.5水解乳蛋白Hanks液）制成组织悬液，然后经2000转分离心20分钟。必要时可加抗生素处理（同上）。 7病毒的分离培养的方法动物接种法 鸡胚培养及病毒的鸡胚接种法组织培养与病毒的细胞感染法 8动物接种法动物接种是最原始的病毒培养方法，常用的动物有小白鼠、大白鼠、田鼠、豚鼠、 家兔，有时也用猴、猿、猩猩等。接种时要根据病毒对动物，组织细胞等嗜性不同而选 择特

3、定的部位，如鼻腔、皮内、皮下、腹腔、脑内、静脉等（见表122）。9小白鼠脑内接种法（示教） 【材料】 1.脑炎病毒（小白鼠脑脊髓炎）悬液：脑组织先用无菌生理盐水洗去血液，再加100脱脂奶水研磨成10毫升悬液，离心沉淀30分钟，吸取上清液。 2.小白鼠：3周龄，体重68克。 10【方法】 11毫升注射器抽取脑炎病毒悬液0.1毫升，去除注射器内的气泡。2取出小白鼠，左手将小白鼠固定，固定时用大拇指和食指握住小白鼠的头部，左手掌轻轻按住小白鼠的体部。3右手以棉签蘸以碘酒，消毒小白鼠的右颊部皮毛4右手拿住注射器在小白鼠眼与耳根连线的中点略偏耳朵的方向注入，进入颅腔，进针23毫米，不要插得太深，注射量为

4、0.020.03毫升。5注射完毕，将用过的注射器煮沸消毒，动物一般在34天开始发病，食欲减退，活动迟纯、耸毛、振颤、慢慢发展为麻痹瘫痪而死亡。11小白鼠滴鼻感染法（示教） 【材料】小白鼠、流盛病毒的鼠肺适应株悬液、无消毛细吸管、无菌小试管、乙醚、棉球及动物罐等。【方法】1首先将小白鼠1只投于带盖的，内放有浸蘸乙醚的棉球的容器内行全身麻醉。注意麻醉的深度，一般不宜太深或太浅，太深时易遭致麻痹死亡或吸人性肺炎，太浅则易在滴注时打喷嚏。122用左手取出小白鼠握在掌中，大拇指及食指抓住耳部使其头部朝前并呈仰卧位 置，另一手将吸有病毒悬液的滴管，慢慢滴于管口而不使其自然掉落呈悬滴状，将悬滴 靠至动物鼻尖

5、，动物在呼吸时带人，一般滴入0.030.05毫升，不宜过多，感染材料如被吸人肺内，容易引起动物肺水肿，往往于接种后一天内死亡。3动物慢慢苏醒，在罐中逐日观察，通常在数日后开始发病，发病的症状常为耸毛，咳嗽、不食、甚至死亡，解剖可观察到肺脏有肺炎或出血性病灶。 13鸡胚培养及病毒的鸡胚接种法 一、鸡胚的孵育 （一）鸡卵的选择 一般都选新鲜、10天以内莱亨鸡（Leghorn bird）的受精卵以保证规格质量上的一致 （二）孵育 孵育时可将鸡卵放人卵箱内进行,气室向上，孵育的最适温度为38-39，相对湿度为4070，孵育8日后，鸡卵应每天翻动12次，以帮助鸡胚发育匀称和防止鸡胚膜粘连。 14（三）检

6、卵 鸡卵孵育45天后，即可用检卵器检查鸡胚发育情况（二天一次）。1未受精鸡卵：在检卵器上仅见到模糊的阴影。2活鸡卵：鸡胚发育4天后，在检卵器上就可见到清晰的血管，鸡卵内有一小黑点（鸡胚），有明显的自然转动。3死胎：如果发现鸡卵血管模糊、扩张、胚胎活动呆滞或不能自主地转动，则可判断胚胎频死或已经死亡，应将其挑捡出来。 鸡胚孵育完毕后，用铅笔划出气室边缘和胚胎的位置待用。 15尿囊腔接种 【材料】新城鸡瘟病毒10毫升稀释液，1012日龄鸡胚，卵垫，1毫升无菌注射器及14号针头，小锉了刀，橡皮乳头、大头针，眼科镊子及小镊子，无菌培养皿、无菌生理盐水，碘酒，酒精棉球。16【方法】 选911日龄鸡胚，照检后划出气室和胎位，在气室边缘上28毫米处避开血管作一标记，将碘酒在此消毒后，用蛋钻钻一小扎（勿损伤壳膜），用注射器注入病毒0.10.2毫升，然后用溶化石蜡封口，置3335孵育（时间见表126）。17（2）剖检及收获收获前鸡胚应置4冰箱过夜，使鸡胚内血液凝固。收获时，用碘酒将气室部卵壳 消毒，将气室处卵壳剥去，（不要将碎片落入壳膜）。然后用无菌手术刀柄从胚胎背部轻轻下压，（切勿压破卵黄囊）再用吸管吸取尿囊液，置青霉素小瓶内，于低温保存。18三、病