分析方法开发化合物特性参数pKaLogPLogD与分离保留关系

1、分析方法开发化合物特性参数pKaLogPLogD与分离保留关系中性化合物由于其疏水性，借助反相色谱法（RPC）即可分离。酸碱 化合物的分析分离在较早前使用离子交换色谱方法，现在常用RPC方法即 可分离分子量1000Da的酸碱化合物。大多数小分子药物或者候选化合物 是酸性或碱性化合物，它们常带有各种官能团，如羟基、羰基、氨基、羧 基、硝基，卤素等。这些化合物的在RPC中的保留与流动相的pH值有密 切的关系。1化合物pKa在方法建立选择流动相的pH范围时，了解化合物的pKa 参数非常关键。对于酸性化合物：HA-A-+H+对于碱性化合物：B+H+BH+化合物酸碱电离常数（pKa ）代表着化合物的酸碱

2、性，预示着它的色 谱保留会受到它的电离程度的影响。一般离子化程度越高，在反相上的保 留越弱，在中性状态上保留最强。化合物的离子化取决于流动相pH和它 的 pKa。化合物的保留与离子化程度的函数关系如下：k0表示化合物呈分子态的保留，k1表示去质子化（离子化）时的保 留，d代表分子的离子化比例（0WdW1）。当pH=pKa时，表示化合物离子化比例为50%。图图1酸碱化合物离子化、pH、pKa和保留k的模拟关系上图1模拟了化合物离子化程度、流动相pH和保留因子k之间的曲 线关系。酸性化合物HA的pKa为5，当流动相pH=5时，它离子化50%，曲线 中处在斜率最大的区域，改变流动相pH值可以最大化改

3、变它的k值；同 理，碱性化合物B的pKa为10，当流动相pH=10时，它离子化50%，曲线 中处在斜率最大的区域，改变流动相pH值也可以最大化改变它的k值， 因此调节流动相pH可以优化色谱的选择性和分离度。当流动相的pH值等 于化合物的pKa时，此时可以最大效应的调节它的保留时间和分离度。图图2保留时间与pH之间的关系如图2，当酸或碱的离子化比例为50%时，改变0.1个pH单位，k值 发生10%的变化，从而引起分离度2.5个单位的变动。意味着，为避免pH 对保留行为的影响，所选流动相的pH最好与样品pKa有1.5个单位的差 异。在色谱方法开发时，对于化合物pKa值的获取并不要求十分准确，通 过

4、它的酸碱基团可以计算得到。表1为常见基团的pKa值估算。比如苯甲酸，它的pKa软件预测为4.1，通过表1可得到芳香族羧酸 为4.0，结果接近。比如苯乙胺，软件预测pKa为9.3，表1得到近似值 10.0。苯胺，软件预测pKa为4.6，通过表1得到近似值5.0。表表1酸碱官能团在水溶液中的pKa近似值2化合物LogP和LogDLogP是化 合物的油水分配系数，常用于表征药物在体内溶解、吸收、分布和转运的 水溶性和脂溶性。在分析方法开发时，了解化合物的LogP，有助于理解 它的疏水性。化合物LogP的测定，是中性条件下化合物在正辛醇和水溶液中的分 配系数比值的对数值。在RPC中，流动相的pH值在1

5、-12都有可能。不同 pH值条件下化合物的电离基团是变动的，其真实的疏水性也在动态变化。 在分析方法开发时只了解化合物的LogP是有局限性的，因此引入LogD， 它代表在不同pH的条件下，化合物在正辛醇和水溶液中的分配系数比值 的对数值。LogD能够真实反应目标化合物在不同pH条件下的疏水性。疏水性是化合物在色谱柱上分离的重要影响因素。色谱柱的选择性差异是化合物被分离的重要前提。基于色谱柱的选择 性，施耐德等人提出了色谱柱对溶质保留的疏水减法模型：模型的左侧表征溶质分子的保留情况，kEB表示只有疏水相互作用的 乙苯的保留。右侧的各项分别表征疏水相互作用（TH项），分子的形 状大小因素（6S项）

6、，相互间的氢键作用（BA+aB项），相互间 的离子交换作用（kC项）。每一项希腊字母代表的是溶质分子的相关 能力，每一项英文字母代表的是色谱柱的相关能力。logD与TH中的T有关，表示化合物疏水作用，pKa与kC中 k相关，表示化合物电离作用。对于常见中性化合物，在不同pH值条件下不发生电离，它在色谱柱 上的保留是规则性的，主要由其疏水性大小决定，比较它们的LogP即可 预测化合物的先后保留行为。对于常见酸碱电离化合物，在色谱柱上的保留是不规则的，除与氢键 有关外，它与pKa和logD有着重要关系。它的保留随着流动相pH值改变 而改变，这个时候比较它们在不同pH值下的LogD可以帮助预测化合物

7、的 保留行为，从而达到分离的效果。对于结构偏大，存在复杂构象，氢键丰富，电荷丰富的化合物，如万 古霉素，使用单个的LogP/LogD参数,、pKa的特性，很难预测它的保留 行为，这个时候施耐德疏水减法模型需要全部考虑进去。LogD可以认为是pKa、LogP两个参数的综合性参数，理解和掌握这 个参数对反相色谱方法开发的研究非常重要。在色谱方法开发阶段，可以 将所有已知结构物质的LogD曲线绘制在一张图上来近似了解和选择适宜 的pH范围。图图3多个药物分子的LogD曲线堆叠图3缓冲液pKa缓冲液是指一种共轭的质子给体和质子受体构成的离子化 合物的溶液，它可以在加入少量的酸或碱时维持溶液pH值的稳定

8、。常见 缓冲液的pKa如表2。表表2常见HPLC缓冲液的pKa列表当缓冲溶液中容质的两种状态（离子态和分子态）浓度相等时，即缓 冲液pKa等于溶液pH时，缓冲能力最大。溶液pH值离缓冲液的pKa越远， 其缓冲能力越小。因此流动相pH值最好在缓冲液pKa1.0范围内，这个 时候的缓冲能力最强。当缓冲液的缓冲能力不足时，易导致容质峰拖尾。增加流动相的缓冲 能力可以通过，扩大流动相pH和溶质pKa之间的差异、增加缓冲液浓度、 减少样品进样体积、调节样品溶液pH值与流动相一致性来实现。下图4为3,5-二甲基苯胺，在不同pH磷酸氢二钾缓冲溶液中的色谱 峰形。化合物pKa为3.8，缓冲溶液pH为4. 0时

9、的缓冲能力最差，前沿 峰严重；pH降低至3. 0时，远离化合物化合物pKa，同时接近缓冲液pKa，溶液缓冲能力增强，峰形逐渐正常。上 述现象是由于缓冲液的缓冲能力强弱导致。图图4缓冲能力不对对峰形影响4有机溶剂和温度对流动相pH和化合物 pKa的影响对于溶质和缓冲液均为酸或碱的情况下，有机溶剂比例变化对 它们的影响是一样的，可以忽略不计；当溶质为酸，缓冲液为碱，或者相 反时，有机溶剂比例变化对于流动相pH和溶质pKa的影响是不同的。对于乙腊，比例每改变10%，pH的校正因子为0.2个单位；对于甲醇， 比例每改变10%，pH校正因子为0.1个单位。假如缓冲液和分析物都是酸性或碱性，有机相的加入对

10、日和pKa 的影响会很大程度抵消掉，总的校正因子约为0；此时，可以直接根据分 析物的pKa来确定配置的缓冲液的pH。假如缓冲液和分析物的酸碱性不一致，即一个是酸性另一个是碱性， 加入有机相时影响会非常大。有机相比例在0-60%的范围内，总的校正因 子为对于乙腊，比例每改变10%，校正因子为0.4个单位，即对于酸性分 析物pH校正因子为+0.4个单位，对于碱为-0.4个单位；对于甲醇，比例 每改变10%，校正因子为0.2个单位，即对于酸性分析物pH校正因子为 +0.2个单位，对于碱为-0.2个单位，如表3。表表3有机相为乙腊时，当分析物和缓冲液酸碱性不一致时的校正因子数据温度的变化对于缓冲液和样品的pKa也会有影响。对于质子化碱，提 高温度会降低有效pKa值。温度对于离