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文档简介

1、- -博苑科技w,JsDS条带蛋白酶解及质谱鉴定完整操作流程仪器：ABI4800MALDI-TOF/TOF串联质谱仪(ABI)、真空冷冻干燥机、水浴锅、Mascot分析软件、移液器、离心管主要溶液配置：脱色液：25mMNHHC0、50%乙腈的水溶液43脱水液1：50%的乙腈溶液脱水液2：100%的乙腈还原液1：含10mMDTT和25mMNHHCO的水溶液43还原液2：50mM碘乙酰胺和25mMNHHCO的水溶液43吸胀液：25mmol/LNHHCO的水溶液43酶解覆盖液：25mM的NHHCO、1O%乙腈的水溶液43酶解工作液：含0.02ug/ul胰蛋白酶的酶解覆盖液蛋白萃取液：含5%TFA、6

2、7%乙腈的水溶液- -IW苑科技“门讥蛋白履组亢整解决力案1、将切取的蛋白胶点转入0.5ml进口离心管中，采用超纯水漂洗两次，2、加入考染脱色液，脱色30min,3、吸出脱色液，加入脱水液1,脱水30min,4、吸出脱水液1,加入脱水液2，脱水30min,真空冻干，5、冻干的胶块加入50uL还原液1,57C温浴lh,6、吸出液体，加入50ul还原液2,室温放置30min,7、吸出液体加入吸胀液，10min8、吸出吸胀液，加入脱水液1,脱水30min,9、吸出脱水液1,加入脱水液2,脱水30min,10、吸出脱水液2,加入10ul酶解工作液，吸胀30min,11、加入20ul酶解覆盖液，37C水

3、浴酶解过夜，12、酶解后上清转移至另一新离心管中,13、加入50ul蛋白萃取液于剩下的胶中，37C水浴30min,5000g离心5min,合并上清,冻干后待做质谱。- -博苑科技质谱及数据库检索严1、将干粉重新溶解于5ul含0.1TFA的溶液中，然后按照1：1的比例与含50%ACN和1%TFA的a-氰基-4-羟基肉桂酸饱和溶液混合，2、取1ul样品进行质谱点靶鉴定，仪器为API4800串联飞行时间质谱仪(MALDI-TOF/TOF)(AppliedBiosystems)，3、采用正离子模式和自动获取数据的模式进行数据采集；PMF的质谱扫描范围为800-3500Da；选择强度最大的10个峰进行二级质谱，4、将一级和二级质谱数据整合并使用GPS3.6(AppliedBiosystems)和Mascot2.1(MatrixScience)对质谱数据进行分析和蛋白鉴定，5、搜索参数如下：数据库为NCBInr；酶为胰蛋白酶；允许最大漏切位点为1;固定修饰为：Carbamidomethyl(C)；可变修饰为：Oxidation(M)；MStolerance为0

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