ngs与其他检测序技术流程的对比-图文

1、组织病理学检查仍是癌症诊断的“金标准”ACSCSCCLC5 FISH ARMS肿瘤点击添加文本点击添加文本点击添加文本点击添加文本肿瘤病理诊断治疗已进入个体化分子时代 免疫组化 一代测序 数字PCR 二代测序检测方法的介绍免疫组化（IHC）荧光原位杂交（FISH）桑格测序（Sanger测序法）扩增阻滞突变（ARMS）-PCR法数字PCR（ddPCR）二代测序检测方法介绍7Copyright 2019. GENESEEQ Technology Inc. All rights reserved.免疫组化染色原理：根据抗原抗体反应和化学显色原理，组织切片或细胞标本中的抗原先和一抗结合，再利用一抗与标

2、记生物素、荧光素等的二抗进行反应，前者再用标记辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶（AKP）等的抗生物素（如链霉亲和素等）结合，最后通过呈色反应或荧光来显示细胞或组织中化学成分，在光学显微镜或荧光显微镜下可清晰看见细胞内发生的抗原抗体反应产物，从而能够在细胞爬片或组织切片上原位确定某些化学成分的分布和含量。免疫组化是从蛋白层面看问题的，与测序不同，一个是因（DNA），一个是果（Protein），所以体内出现一些未知突变，如果对蛋白功能产生影响，也是可以看出来的。80分1分2分3分荧光原位杂交（FISH）定义：荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization,

3、FISH)是通过荧光标记的DNA探针与细胞核内的DNA靶序列杂交，并在荧光显微镜下观察分析其结果的一种分子细胞遗传学技术。它的基本原理是：如果被检测的染色体或DNA纤维切片上的靶DNA与所用的核酸探针是同源互补的，二者经变性-退火-复性，即可形成靶DNA与核酸探针的杂交体。将核酸探针的某一种核苷酸标记上报告分子如生物素、地高辛，可利用该报告分子与荧光素标记的特异亲和素之间的免疫化学反应，经荧光检测体系在镜下对待测DNA进行定性、定量或相对定位分析。分析10Copyright 2019. GENESEEQ Technology Inc. All rights reserved.荧光原位杂交(FI

4、SH)检测以HER2为例FISH检测乳腺癌细胞HER2扩增代表性图例高倍扩增无扩增扩增无扩增DNA序列测定的意义 DNA的序列测定是分子生物学研究中的一项非常重要的和关键的内容。如在基因的分离、定位、基因结构与功能的研究、基因工程中载体的组建、基因表达与调控、基因片段的合成和探针的制备、基因与疾病的关系等等，都要求对DNA一级结构的详细了解。桑格测序原理原理：利用DNA聚合酶，以待测单链DNA为模板，以dNTP为底物，设立四种相互独立的测序反应体系，在每个反应体系中加入不同的双脱氧核苷三磷酸（ddNTP）作为链延伸终止剂。在测序引物引导下，通过高分辨率的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，放射自显影检

5、测后，合成链序列，由此推知待测模板链的序列 。14Copyright 2019. GENESEEQ Technology Inc. All rights reserved.Sanger测序的流程结果解读扩增阻碍突变系统(ARMS) -又称等位基因特异性扩增（ASA），利用PCR引物的3 端末位碱基必须与其模板DNA互补才能有效扩增的原理，设计等位基因特异性 PCR扩增引物。ARMS（ASA）的特点是：“只有在引物3碱基与模板配对时才能出现PCR扩增带，野生型的不扩增”优势灵敏度高，重复性好，对标本突变率要求底操作简单，仪器费用较低廉检测时间短不足仅能检测已知突变类型不能得到具体碱基突变类型AR

6、MS法检测17数字微滴PCR (ddPCR)通过将微量样品扩大倍数稀释和分液(partitioning)，直至每个样品中所含有的待测分子数不会超过1个，再将所有样品在相同条件下进行PCR扩增，并对发生了扩增反应的样品逐个进行计数的一种技术。Copyright 2019. GENESEEQ Technology Inc. All rights reserved.ddPCR的工作流程原理是在Sanger测序方法的基础上，用不同颜色的荧光标记四种不同的dNTP。通过碱基互补配对原则逐一的添加标记过的dNTP，每添加一种dNTP就会释放出不同的荧光，根据捕捉的荧光信号并经过特定的计算机识别、转换，从而

7、生成相应的序列信息。新一代高通量测序(NGS)的原理四色荧光判别ATCG四种碱基 激光超高分辨率照相机 Miseq为首个FDA批准临床的 高通量测序仪 国际NGS高分文章，绝大多数使用Hiseq平台19新一代高通量测序(NGS)能同时检测不同形式的基因突变 Marc Ladanyi. 2019 ASCO Annual Meeting20 检测方法比较检测方法优势劣势可检测的变异形式AMRS-PCR1、灵敏度3%-10%2、扩增和检测同时进行，封闭的体系，减少污染的可能性1、只能检测已知突变2、如果检测突变点或者类型较多，出现特异产物概率也增加3、当检测位点较多时，对DNA样本需求增加点突变、小

8、片段插入/缺失无法测融合、大片段以及热点测序荧光原位杂交FISH1、灵敏度高、特异度高2、空间定位准确，可同时分析分裂期和间期多个细胞，并进行定量1、通量低、成本高2、对操作和判读技术要求高，不同读片者判读差异较大拷贝数变化、大片段插入/缺失、融合/重排。扩增的金标准免疫组化IHC1、可对组织和细胞中相应的抗原进行定性、定位及定量研究2、经济快捷1、抗体的选择2、检测者组织的固定3、观察者解释方面的差异仅检测蛋白表达水平Sanger测序1、测序长度2、准确性高，灵敏度20%-30%3、能处理的处理重复序列和多聚序列1、通量低、成本高2、对样本中肿瘤细胞的含量和比例要求较高3、灵敏度低点突变、小

9、片段插入/缺失二代测序1、大规模、高通量2、能检测各种变异形式3、灵敏度1%-3%1、成本较高2、引入PCR过程会在一定程度上增加测序的错误率，并且具有系统的偏向性，同时读长也比较短3、对数据注释和报告解读要求高点突变扩增融合/重排插入/缺失21Copyright 2019. GENESEEQ Technology Inc. All rights reserved.各种方法检测的对比方法检测层面样本需求优势劣势IHCProtein组织 直接展现表达结果，直观主观判断，对操作人员要求较高，阳性判定不确定ARMSDNA组织，血液速度快，精准度较高无法测融合，扩增及大片段测序，热点测序ddPCRDN

10、A组织，血液单位点精准度非常高，可以进行动态监测多位点血检匹配度不高，热点测序FISHDNA组织扩增是金标准，并且可以测融合主观判断，对操作人员要求较高，对融合的判别要求非常高，结果容易出错世和DNA/RNA普适性一次检测所有突变类型，多基因，精准度高价格略高，周期略长22Copyright 2019. GENESEEQ Technology Inc. All rights reserved.总结SummaryNGS只需要微量样本就可以一次性检测所有的突变类型FISH做扩增与融合对实验室研判人员的要求较高，NGS通过优化算法，降低人工出错的比率。阴性对照极为重要，具有质控和探查种系突变的作用A

11、RMS,ddPCR等传统一代测序方法在热点测序这一块的确精准度较高，但是本质上仍旧是热点测序，不能满足越来越大的检测需求世和专有探针库保证了前期提取的DNA质量23Copyright 2019. GENESEEQ Technology Inc. All rights reserved.NGS & ctDNA 技术优势Copyright 2019. GENESEEQ Technology Inc. All rights reserved.NGS技术特点及优势检测全面精准度高周期短样本需求少全自动化的大数据分析方法时时更新的医学数据库高通量单次检测中同时发现多个基因的多种突变 包括单碱基突变、碱基

12、缺失、碱基插入和基因融合单次反应只能针对一种突变进行检测，并只能检测一种突变类型同时对416个致癌基因 进行测序展现所有突变每次反应只检测单个基因一种突变世和的技术在单次检测中对每个碱基覆盖600次以上，杜绝假阳/阴性结果技术局限，假阳/阴性错误率高只需一次微量 肿瘤样本，并且可以检测手术样本，血液/积液样本，FFPE石蜡样本等多次检测导致样本量大、价格高、耗时长实现数据分析的算法优化和分析自动化，快速处理海量病人数据，杜绝人为错误技术局限无法及时有效处理海量病人数据以FDA逾三万份临床数据为基础，报告切实有用，有效帮助医生和病人选择高敏感性的药物不同实验室的各种报告而造成的信息重复或混乱，无

13、法保证临床数据库的完善性和时效性检测流程高度自动化，7天 提供全面准确报告多次反复测试，造成耗时长，而且由于技术局限无法提供全面的报告上一代传统基因检测高通量测序Copyright 2019. GENESEEQ Technology Inc. All rights reserved.NGS与液体活检结合可有效解决传统检测面临的挑战Copyright 2019. GENESEEQ Technology Inc. All rights reserved.ctDNA液体活检特点和优势27克服肿瘤异质性与组织高度匹配取样无创简便动态监测药物疗效动态监测耐药情况有效评估预后Nat Rev Clin On

14、col. 2019 Aug;10(8):472-84. 没有组织怎么办？Copyright 2019. GENESEEQ Technology Inc. All rights reserved.初始诊断性活检是通过组织病理学、免疫组化和分子学特征描绘进行评估的，根据结果制订治疗方案在获得性耐药时进行再活检，并采用同样的方法重新分析以发现耐药时收集的标本与治疗前标本的差异该过程在各治疗阶段时重复进行应形成可能的细胞株和患者衍生的移植瘤模型以促进耐药机制和治疗作用的功能性研究Politi K, et al. Clin Cancer Res. 2019 May 15;21(10):2213-20.

15、分子学特征和再活检与癌症治疗的整合28检测全面克服肿瘤异质性肿瘤具有复杂的时空异质性不同位置具有不同病灶肿瘤亚克隆Andriy Marusyk, et al. Nature Review Cancer. 2019.Almendro V, et al. Annual review of pathology 2019.由于组织检测只取样于肿瘤的某一部位，无法衡量肿瘤组织的异质性，导致检测信息不全面。ctDNA：由于ctDNA来源于患者体内不同位置的肿瘤细胞，同时经过人体天然血液循环系统混匀，其携带的肿瘤基因信息更全面，规避了肿瘤组织的异质性。灵敏度高准确度高假阳性率低 Zheng et al. S

16、ci Rep6:20913 (2019).Thierry et al. Nat Med. 2019; 20 (4):319-449.为什么要进行ctDNA基因检测现有的基于血清蛋白生物标记物（例如CA-125和PSA）的无创检测方法存在一定数量的假阳性与假阴性结果，并不能对肿瘤的进展做出准确判断ctDNA可从血液中较易分离 （liquid biopsy），并携带肿瘤特异性的体细胞突变，因此极为适合作为肿瘤无创诊断及监测的生物标记物对ctDNA进行基因检测还可以及时发现肿瘤复发后产生的抗药性突变，而及时对治疗方案进行调整尽管肿瘤本身是肿瘤DNA的最直接来源，但是通过活检或手术获取肿瘤组织是侵入性

17、的，具有一定风险的。而且有些癌症病人不宜进行手术，无法获得肿瘤组织进行基因检测，以帮助制定治疗方案31ctDNA检测中遇到的问题及挑战ctDNA总量取决于：样品提供人的健康状态取血及保存运输血液/血浆样品的条件血浆的制备方法DNA的提取方法以及DNA的定量方法世和基因的技术优势：大幅提高ctDNA回收率从微量ctDNA建立测序文库ctDNA在血液中含量极少 ，片段较小，提取方法及其重要1建库及富集的产量2事实上，ctDNA检测的核心在于前期准备以确保ctDNA文库的多样性，保证被检测样本有代表性是下游测序及分析的基石32Copyright 2019. GENESEEQ Technology I

18、nc. All rights reserved.那么多公司，为什么选择我们？世和的优势33世和的优势来自于步步优化，精益求精34世和的优势来自于步步优化，精益求精优势在于每步优化！QC步骤35样本收集两小时之内分离血浆收到血样后2小时内分离血浆血浆多种运输条件实验室模拟不能输在起跑线上！运输全血至总部再分离血浆季节地域温差大，影响质量直接影响检出率世和基因其他公司Sci Transl Med. Aug 26, 2019; 7(302): 302ra1332小时内收集血浆是临床试验、高分论文金标准！分离全血收集血浆，时间精至分钟！36DNA提取I血浆ctDNA富集小片段ctDNA，去除干扰小片段

19、含肿瘤特异突变大片段不含肿瘤特异突变血浆DNA经过大小片段分离有效富集小片段ctDNA！更丰富的起始原料世和基因数据37DNA提取II石蜡组织自主研发基于qPCR的样本质控0.5率先使用荧光定量PCR法用于FFPE样本质控自主设计引物，经过8个参数计算模型， 确保通过QC样本测序质量避免交联过于严重的石蜡样本进入流程测序质量好测序质量差世和基因数据，基于100例临床病人石蜡样本测序结果38样本建库不计成本的大量进口试剂优化上百种进口试剂反复搭配优化极大提升建库效率39靶向富集I基因捕获探针Mass spec质控单独合成基因靶向富集15000余个探针探针库反复优化14次，历时3年，保证每个基因每

20、个外显子覆盖探针单个合成，Mass Spec保证质量7项核心专利探针单独合成质谱分析纯化世和探针库剪切探针库芯片大规模合成芯片合成探针的缺点：大规模一次合成多个探针统一剪切探针的完整性等品质无任何保证大部分探针都不完整，导致基因捕获效率大大降低芯片合成探针的缺点反复15000次40靶向富集II为什么一定要“好”探针？什么是探针的均一性（Uniformity）？探针覆盖不均一探针覆盖均一ALK19内含子测序数据的重要参数，除了测序深度，还有探针均一程度换句话说，如果EGFR覆盖3000X，而ALK只覆盖300X，将会严重影响检测敏感性检测灵敏度是由覆盖最低的基因决定的如不均一，等于没测！41世和基因IlluminaHiseq4000/Miseq其他测序公司IlluminaNextseq500四色荧光判别ATCG四种碱基 激光超高分辨率照相机 Miseq为首个FDA批准临床的 高通量测序仪 国际NGS高分文章，绝大多数使用Hiseq平台二色荧光判别ATCG LED照相机 准确率和灵敏度较差 主要用于产前检测上样测序Illumina Hiseq4000/Miseq与国际接轨42数据分析报告生成I生信分析和突变分析的完美结合生信分析各类型突变反复研讨数据库比对最终突变列表ABC报告止于”一键生成”？报告初