酵母表达系统与方法

1、 酵母表达系统与方法 1 酵母表达系统的产生 基因工程技术的发展为用微生物合成和生产外源蛋白展示出广阔的前景。长期以来，人们用大肠杆菌作为宿主表达了多种蛋白。这是因为大肠杆菌具有若干优点，如：遗传背景和生化特性清楚、容易操作、生长迅速、营养需求简单等。 但大肠杆菌表达系统存在若干缺陷：A：缺少真核生物的蛋白翻译后修饰和加工，如剪切、糖基化、形成二硫键等；B：表达的蛋白多以包含体形式存在，需要经过复杂的复性才能恢复构象和活性；C：背景杂蛋白很多、纯化起来麻烦；D：表达量一般不是很高。 2 自1979年，为了克服大肠杆菌表达系统的缺点，发展了酵母表达系统。最先使用的是酿酒酵母，因为酿酒酵母在酿酒业

2、和面包业使用有数千年的历史，被认为是安全生物；此外，酵母是单细胞低等真核生物，它既具有原核生物的易于培养、繁殖快、便于基因工程操作等特性，同时又具有真核生物的蛋白质翻译后加工的功能，有适于真核生物基因产物正确折叠的细胞内环境和糖链加工系统，还能分泌外源蛋白质到培养液中，利于纯化，并可减轻宿主细胞的代谢负荷。特别是由于酿酒酵母2质粒的发现和酵母转化技术的突破,酿酒酵母基因工程表达系统因此而建立并应用。 1981年Hizeman等人首次报道了人重组干扰素基因在酿酒酵母中表达并获成功。3 酵母表达系统的组成 宿主：酿酒酵母、裂殖酵母、乳酸克鲁维亚酵母、 巴氏毕赤酵母等。 质粒载体 1. 质粒类型:

3、自主复制型质粒（Yeast replicating plasmid, YRp） 着丝粒质粒（Yeast centromeric plasmid, YCp ） 附加体质粒(Yeast episomal plasmid,YEp) (自主复制,拷贝数高,不稳定, 易丢失) 整合型载体(Yeast integrating plasmid,YIp) (稳定性好,拷贝数低) YAC载体（Yeast artificial chromosome, ） 2. 选择标记: A.营养缺陷型选择标记(亮氨酸合成酶基因leu2,色 氨酸合成酶基因tri1,尿氨酸合成酶基因ura3,组氨 酶合成酶基因his3) B.显性

4、选择标记(氨基酸糖甙类抗生素G418,氯酶素， 潮酶素) 3. 外源基因表达的相关元件:启动子(pgk1,AOX, LAC4)、终止子 分泌信号序列 4 主要酵母表达系统酿酒酵母表达系统 Saccharomyces cerevisiae (酿酒酵母)乳酸克鲁维亚酵母表达系统 Kluyveromyces lactis （乳酸克鲁维亚酵母） 甲醇营养型酵母表达系统 Candida bodinii Hansenula polymorph(多形汉逊酵母) Pschia methanolica Pichia pastoris(巴氏毕赤酵母) 裂殖酵母表达系统 Schizo saccharomyces p

5、ombe （粟酒裂殖糖酵母）5不同酵母表达系统的特点 酿酒酵母表达系统 表达载体：自主复制型和整合型 筛选标记: LEU2、URA3 启动子： PGK1、 PHO5、CUP1 67成功表达的外源蛋白实例： 人重组干扰素酿酒酵母表达系统的主要不足： 分泌能力低 不能使异源蛋白正确糖基化 所表达的蛋白质的C-末端被截短 8乳酸克鲁维亚酵母表达系统 表达载体：整合体型载体。 附加体型载体：1.胞质线性双股DNA 杀伤质粒;2. 含有乳酸克鲁维亚酵母ARS序列;3. 稳定高拷贝数2 样pKD1和pKL1质粒。 启动子：LAC4。 乳糖作为唯一的能源和炭源。 9成功表达的外源蛋白实例： 人血清蛋白和白细

6、胞介素1乳酸克鲁维亚酵母表达系统的独特优点： 可以高密度发酵； 不需要甲醇防爆装置； 工业化生产时不降低生产率及酵母菌的再繁殖能力。10甲醇营养型酵母表达系统 甲醇作为唯一的能源和炭源 11 表达载体：整合体型载体 （Invitrogene公司已开发出多种巴氏毕赤酵母表达载体 如：pPIC9, pHIL-D2, pHIL-S1,pPICZA, pPICZB, pPICZC系列和 pPICZaA, pPICZaB, pPICZa系列适 合于胞内和分泌的表达载体） 筛选标记：HIS4 启动子：AOXI 作为分泌型表达时，外源基因需要接上一段信号肽序列1213一种常用的巴氏毕赤酵母表达载体结构图14

7、1516 甲醇营养型的两种酵母表达系统比较17 甲醇营养型酵母表达系统的主要优点： 1. 应用AOX启动子，转录效率高，易于诱发调控； 2. 表达质粒易于整合到基因组,不易丢失,适于高密度发 酵,产量高(培养基中干物质含量高达130 mg/L)； 3.表达产物分拣进入过氧化物酶体,利于工业生产和分 离纯化； 4. 对分泌蛋白的糖基化修饰和糖基化程度适中； 5. 高效表达 (12 g/L)。 18 外源蛋白质 产生量（g/L） 文献转化酶2.34D-丙氨酸羧肽酶0.85-淀粉酶2.56Kunitz 蛋白酶抑制剂(AbPP)1.07瞬时抗凝蛋白 (TAP)1.78破伤风毒素片段C12.09百日咳抗

8、原PGP3.010人免疫缺陷病毒膜外糖蛋白1.311肿瘤坏死因子(TNF)10.012人转铁蛋白N端4.013表1 外源蛋白质在甲醇酵母中的高效产生1920甲醇营养型酵母表达系统的主要不足： 1. 甲醇不适于食品工业生产； 2. 易发生火灾。21 裂殖酵母表达系统的特点 1. 以分裂的方式繁殖 2. 裂殖酵母与哺乳动物有许多相似之处 3. 表达的产物具有天然的构象和活性 4. 高效表达载体: pTL2M (含有高效的hCMV启动子)22232425裂殖酵母表达系统的优点 尽管裂殖酵母作为外源基因表达系统的发展远远落后于酿酒酵母和巴氏毕赤酵母，但随着载体的发展，裂殖酵母不仅可以表达胞内蛋白，也能

9、高效表达膜蛋白和分泌蛋；特别是裂殖酵母表达系统可以使外源基因的产物保持天然的特性。因此，裂殖酵母作为外源基因表达系被认为是最有前途的。26主要酵母表达系统特性比较27 外源蛋白在酵母菌中表达的一般步骤 （1）将编码外源蛋白的DNA序列克隆到含有 酵母启动子和转录终止子的表达框中； （2）转化及在宿主中稳定维持该DNA融合产 物； （3）外源蛋白在特定培养条件下合成； （4）外源蛋白的纯化与及其天然产物的比较。 28酵母表达系统的方法 以巴氏毕赤酵母表达系统为例表达载体构建 选用合适的内切酶将外源基因克隆到毕赤酵母表达载体的多克隆位点。292. 大肠杆菌转化 采用高频转化法将构建的表达载体转入E

10、. coli DH5 ,以少量抽提法制备质粒并进行酶切鉴定。重组表达载体的大量抽提及其线性化 可采用QIAGEN公司的质粒纯化试剂盒大量制备质粒，并用BglII酶对重组表达载体酶切线性化（重组表达载体只有线性化，整合效率才会大大提高，环状质粒整合效率很低）。304.酵母转化 常见的四种方法:电击法、原生质球法、PEG法和氯化锂法。 电击法：对于P. Pasroris菌株SMD1168，加入50 g 线性化重组质粒，在50 F，1500 V的条件下，可用Electroporator II高压脉冲仪进行电击。电击后的细胞涂在含有100 g/mL氨苄霉素的YPD培养基（1%yeast extract

11、, 2%peptone, 2% dextrose）上，并在30培养23天直至长出菌落。315.转化子筛选 初选: 转化子可先在不含组氨酸的培养基上初选。 成功的转化子可以在不含组氨酸的培养基上生 长，反之不会生长。 复选： 方案一（少量转化子）：提取转化子DNA，用外源 基因两侧特异性引物进行PCR扩增筛选。 方案二（大量转化子）：采用原位点杂交，即把 相同量的不同转化子点在NC膜上，在原位对酵母 细胞壁进行裂解，使之释放DNA。DNA经变性、中 和后，与外源基因制备的探针进行杂交。这种方 法不仅可以筛选大量转达化子，而且可以鉴定多 拷贝。326. 转化子表型鉴定 确定转化子是Mut+型还是M

12、utS型？ MutS型: 当AOX1基因缺失,只存在AOX2时,大部分的乙醇氧化酶活力丧失,细胞利用甲醇能力降低,在甲醇介质上生长很慢。在MD平板上生长快，而在MM平板上生长很慢。 Mut+型: AOX1基因存在时，细胞利用甲醇能力正常，在甲醇介质上生长较快。在MD和MM板上生长差别不大。337. 诱导表达 外源蛋白在甲醇酵母中的表达分两步:菌体生长和蛋白诱导表达。 菌体生长：先在以甘油为碳源的培养基上培养菌体，至OD600 值为23。 诱导表达：将菌体悬浮在以甲醇为炭源的培养基（ 1%yeast extract, 2%peptone, 1.34% YNB (yeast nitrogen base),1%methanol）中于30条件下诱导表达,每隔24小时加一次甲醇,以弥补甲醇的损失。 348. 外源蛋白的分离纯化 将培养液进行离心,收集上清液过0.2 m滤