基因组序列诠释强伯勤

1、关于基因组序列诠释强伯勤第一张，PPT共七十一页，创作于2022年6月问 题基因组序列所包含的全部遗传信息是什么？基因组作为一个整体如何行使其功能？用什么方法寻找基因，研究基因地功能呢？第二张，PPT共七十一页，创作于2022年6月1. 寻找基因1.1 根据开放读框预测基因 起始密码子 ATG第一个ATG的确定(依据Kozak规则); Kozak规则是基于已知数据的统计结果. 所谓Kozak规则，即第一个ATG侧翼序列的碱基分布所满足的统计规律.第三张，PPT共七十一页，创作于2022年6月Kozak规则: 若将第一个ATG中的碱基A，T，G分别标为1，2，3位，则Kozak规则可描述如下：(

2、1)第4位的偏好碱基为G；(2)ATG的5端约15bp范围的侧翼序列内不含碱基T；(3)在-3，-6和-9位置，G是偏好碱基；(4)除-3，-6和-9位，在整个侧翼序列区，C是偏好碱基。第四张，PPT共七十一页，创作于2022年6月 信号肽分析软件(SignalP http:/www.cbs.dtu.dk/services/signalP ) 把预测过程中证实含完整mRNA 5端的序列翻译为蛋白序列; 然后用SignalP软件对前50个氨基酸序列(从第一个ATG对应的甲硫氨酸Met开始)进行评估，如果SignalP分析给出正面结果，则测试序列有可能为信号肽; 信号肽分析第五张，PPT共七十一页

3、，创作于2022年6月 终止密码子 终止密码子: TAA，TAG，TGA GC% = 50% 终止密码子每 64 bp出现一次； GC% 50% 终止密码子每100200 bp 出现一次； 由于多数基因 ORF 均多于50个密码子，因此最可能的选择应该是 ORF 不少于100 个密码子。第六张，PPT共七十一页，创作于2022年6月 3端的确认 3端的确认主要根据Poly(A)尾序列,若测试DNA片段不含Poly(A)序列，则根据加尾信号序列“AATAAA”和BLAST同源性比较结果共同判断。第七张，PPT共七十一页，创作于2022年6月 非编码序列、内含子高等真核生物ORF阅读的复杂性：基因

4、间存在大量的非编码序列（人类基因组中是70%）绝大多数基因含有非编码的内含子。 高等真核生物多数外显子长度少于100 个密码子，有的不到50个密码子甚至更少；不能根据ORF长度判断读框的准确性。第八张，PPT共七十一页，创作于2022年6月编码同一氨基酸的不同密码子称为同义密码，其差别仅在密码子的第3位碱基不同。不同种属间使用同义密码的频率有很大差异： 如人类基因中， 丙氨酸（Ale）密码子多为GCA,GCC或GCT,而GCG很少 苏氨酸（Thr）密码子多为ACA,ACC或ACT,而ACG很少 密码子偏爱性第九张，PPT共七十一页，创作于2022年6月 密码子偏爱性 高等植物207个基因单子叶

5、植物53个，6个单子叶种群，18种氨基酸有16种氨基酸的密码子摇摆碱基为G+C双子叶植物154个，35个双子叶种群，只有7种氨基酸的摇摆碱基是G+C，其余均为A+T密码子偏倚 codon bias，原因不明。第十张，PPT共七十一页，创作于2022年6月 外显子内含子边界外显子和内含子的边界有一些明显的特征：如:内含子的5端或称供体位（donor site）常见的顺序为 5AGGTAAGT-3；3端又称受体位（acceptor site), 多为5PyPyPyPyPyPyCAG-3(“Py”嘧啶核苷酸，T或C)；但是由于边界序列常有例外，仅适用于一定范围。第十一张，PPT共七十一页，创作于20

6、22年6月上游控制序列 几乎所有基因（或操纵子）上游都有调控序列，它们可与DNA结合蛋白作用，控制基因表达。 通过同源性比较来预测mRNA的5端，最常用的与转录起始位点相关的数据库是真核启动子数据库(The TRADAT Project , Eukaryotic Promoter Database, EPD. http:/www.epd.unil.ch/ )。 另外个别生物基因组的特有组成也可作为判别依据，如脊椎动物基因组许多基因的上游都有CpG岛。第十二张，PPT共七十一页，创作于2022年6月 内含子和外显子序列差异内含子受选择压力小，突变多。由于碱基C 到A，内含子A/T比例高内含子A/

7、T比例高，所以终止密码子出现的频率高。第十三张，PPT共七十一页，创作于2022年6月 软件预测 采用NCBI的ORF预测软件 ( ORF finder: /gorf/orfig.cgi )判断ORF的可能范围。第十四张，PPT共七十一页，创作于2022年6月基因注释软件Genscan 重于信号指令：起始密码、终止密码、剪接受体位和供体位序列等FgeneSH 重于内容指令：密码子使用偏好、内含子外显子的差异等TWINSCAN和SGP2根据相似性和一致性第十五张，PPT共七十一页，创作于2022年6月基因注释软件缺点外显子注释的准确率 25%第十八张，PPT共七十一页，创作于2022年6月同源性

8、：homology起源于同一祖先但序列已经发生变异的序列，分布在不同物种间的同源基因，只有是与非的区别。一致性：identity同源DNA序列的同一碱基位置上相同的碱基成员，或者蛋白质中同一氨基酸位置相同的氨基酸成员的比例，用%表示。相似性：similarity 同源蛋白质的氨基酸序列中一致性氨基酸和可取代氨基酸所占的比例。比较氨基酸和基因的同源性？第十九张，PPT共七十一页，创作于2022年6月分子杂交可确定DNA片段是否含有表达顺序Northern blot：指将待测DNA样品标记后与RNA杂交，以判断RNA中是否含有DNA的转录产物。但在操作中存在一些问题1.3 试验确认基因第二十张，P

9、PT共七十一页，创作于2022年6月1977年J.C.Alwin首创Northern blotting 第二十一张，PPT共七十一页，创作于2022年6月问题解决方案A 某一基因的转录产物进行可变剪接或该基因为某一多基因家族的成员时，会出现多个杂交带设计其他实验区分第二十二张，PPT共七十一页，创作于2022年6月第二十三张，PPT共七十一页，创作于2022年6月心肌特异性蛋白第二十四张，PPT共七十一页，创作于2022年6月问题解决方案B 基因的表达具有组织特异性及发育阶段的差别，而选择的RNA样品中不一定含有该基因产物尽可能多地收集各种不同发育时期及不同组织器官的RNA第二十五张，PPT共

10、七十一页，创作于2022年6月问题解决方案C 某些基因产物丰度极低或不易提取适当提高RNA上样量，或先以已知的DNA序列设计引物从mRNA中扩增基因产物第二十六张，PPT共七十一页，创作于2022年6月C 基因表达产物丰度的问题拟Northern 杂交 根据已知的DNA顺序设计引物，从mRNA群体中扩增基因产物，再以DNA为探针与之杂交。动物园杂交 根据亲缘关系相似的物种，其基因的编码区相似性较高，而非编码区的同源性很低的原理。第二十七张，PPT共七十一页，创作于2022年6月第二十八张，PPT共七十一页，创作于2022年6月DNA顺序中基因位置的确定 cDNA测序受两个方面的影响：一是相关c

11、DNA在cDNA文库中出现的频率；二是cDNA的完整性第二十九张，PPT共七十一页，创作于2022年6月如何获取基因全长cDNA序列？A cDNA 文库构建B RACE 技术第三十张，PPT共七十一页，创作于2022年6月干扰cDNA筛选基因的因素：目标cDNA所占比例很低分成亚群进行筛选cDNA均一化 影响cDNA测序的因素与mRNA的反转录有关第三十一张，PPT共七十一页，创作于2022年6月cDNA文库构建(CLONTECH)第三十二张，PPT共七十一页，创作于2022年6月cDNA文库构建(CLONTECH)第三十三张，PPT共七十一页，创作于2022年6月5RACE(CLONTECH

12、)第三十四张，PPT共七十一页，创作于2022年6月3RACE(CLONTECH)第三十五张，PPT共七十一页，创作于2022年6月确定DNA顺序中基因的位置A 通过对全长cDNA序列的测序、对比，以及与基因组DNA的比较，确定基因所在的区域；B 通过物种已建立遗传图和物理图来确定基因的位置；第三十六张，PPT共七十一页，创作于2022年6月利用计算机分析基因功能2、基因功能的预测2.1 同源性确定基因功能2.2 同源性分析在酵母基因组计划中的应用第三十七张，PPT共七十一页，创作于2022年6月2.1 同源性确定基因功能种间同源基因或直系基因（orthologous gene）：指不同物种之

13、间的同源基因，它们来自物种分化以前的共同祖先种内同源基因或平行基因（paralogous gene） 同一物种内的同源基因，它们常常是多基因家族的不同成员第三十八张，PPT共七十一页，创作于2022年6月同源基因一般不会有完全一致的核苷酸序列，因为不同的基因或不同的生物都会独立地发生随机突变，但它们有相似的序列，大部分未突变的核苷酸位置是相同的 同源性分析可以给出整个基因或其中某一区段功能的有关信息第三十九张，PPT共七十一页，创作于2022年6月2.2 同源性分析在酵母基因组计划中的应用酵母基因组大约含有6000个基因30是通过传统遗传学分析得到的另外70是用同源性分析获得第四十张，PPT共

14、七十一页，创作于2022年6月3.1 基因失活在基因功能分析的作用3.2 基因的超表达用于功能检测3、实验确认基因功能第四十一张，PPT共七十一页，创作于2022年6月3.1.1 基因剔除(knock-out) 最简便的基因失活的方法. 主要原理: 在一段无关DNA 片段的两侧连接与代换基因两侧相同的顺序，将这一构建导入目的细胞，由于同源片段之间的重组，可使无关片段取代靶基因,整合到染色体中。为了便于筛选，用于取代的外源DNA中含有报告基因。3.1 基因失活在基因功能分析的作用第四十二张，PPT共七十一页，创作于2022年6月tk 胸苷激酶标记基因 gangcyclovirneor 新霉素抗性

15、基因G418第四十三张，PPT共七十一页，创作于2022年6月第四十四张，PPT共七十一页，创作于2022年6月3.1.2反义RNA 反义RNA是由基因的负链编码，可与正义RNA (sense RNA)或DNA 编码顺序结合，干扰mRNA 的转录，加工和转运，调控基因的表达。第四十五张，PPT共七十一页，创作于2022年6月构建反义RNA 表达载体: 将全目的基因或部分目的基因反向插入表达载体 转化目标生物 获得转基因个体或品系 分析转基因植株在生理、生化、形态等方面的变异 判别目的基因的功能第四十六张，PPT共七十一页，创作于2022年6月正义表达载体反义表达载体第四十七张，PPT共七十一页

16、，创作于2022年6月反义RNA 作用机理： A 干扰翻译的起始与延伸，可与翻译起始顺序及编码序列结合形成双链RNA，随之被细胞降解。 B 与mRNA 的引导顺序结合，阻止核糖体的附着，使翻译无法启动。 C 反义RNA与mRNA形成双链分子后，使RNA多聚酶脱离模板，转录终止。第四十八张，PPT共七十一页，创作于2022年6月3.1.3 RNA干涉 RNAi是通过双链RNA的介导,特异性地降解相应序列的mRNA,从而阻断相应基因表达的转录后水平的基因沉默机制.第四十九张，PPT共七十一页，创作于2022年6月RNAi 作用机理A dsRNA核酸内切酶Dicer被激活，它把dsRNA加工成212

17、5 个核苷酸长的RNA链；B 这些小片段RNA(siRNA)作为另一个核糖核酸复合体RISC(RNA-induce silencing complex,RNA诱导沉默复合体)的指引物，结合到RISC上，使之识别并降解mRNA，从而导致与双链RNA同源的基因沉默；第五十张，PPT共七十一页，创作于2022年6月第五十一张，PPT共七十一页，创作于2022年6月RNAi设计方法及应用A Fraser 合成与开放读码框相对应的双链RNA或利用细菌克隆表达这些双链RNA微量注射和喂食干扰同源基因的表达B Chuang 等设计出嵌合体结构 连接强启动子大量表达双链mRNA干扰同源基因的表达第五十二张，P

18、PT共七十一页，创作于2022年6月HbF基因的RNAi载体构建第五十三张，PPT共七十一页，创作于2022年6月RNAi技术的优缺点RNAi最根本的特点是特异性RNAi具有特殊的穿越能力，而且干扰作用会传给后代；RNAi对一些低水平表达的基因的RNAi现象并不明显，而且几个有相同或相似序列的基因，RNAi也会同时作用与它们。第五十四张，PPT共七十一页，创作于2022年6月3.2 基因超表达增加基因的拷贝数采用强启动子促使基因超表达第五十五张，PPT共七十一页，创作于2022年6月构建转座子突变库酵母双杂交（yeast two-hybridization）3.3其他方法第五十六张，PPT共七

19、十一页，创作于2022年6月3.3.1 转座子插入突变第五十七张，PPT共七十一页，创作于2022年6月 上世纪三十年代，玉米遗传学家 Barbara McClintock在研究中发现了玉米籽粒色斑不稳定遗传的现象，可能是一种可转移的遗传因子。第五十八张，PPT共七十一页，创作于2022年6月1944：美国国家科学院院士1945：美国遗传学会主席1983：Nobel Prize ，35年后将转位因子的重大发现归功于她McClintock（1902-1992）第五十九张，PPT共七十一页，创作于2022年6月 Ac和Ds这两个因子都位于玉米的第九号染色体短臂，在色素基因C的附近。Ac因子全长4.

20、5kb，有5个外显子，其产物是转座酶。Ac因子两端是长11bp的反向重复序列(IR)； Ds因子长0.4-4kb，它的中间(在转座酶基因中)有许多种长度不等的缺失, Ds的两端也都有11bp的反向重复序列。第六十张，PPT共七十一页，创作于2022年6月 Ac-Ds转座元件结构示意图。右边示Ac及Ds元件的单链DNA末端反向重复配对所形成的茎环结构，这种结构可能对转座有意义第六十一张，PPT共七十一页，创作于2022年6月玉米转座因子对胚乳颜色的影响 第六十二张，PPT共七十一页，创作于2022年6月35S Ac转座酶 NPTII IAAHAc TATA GUS NPTII IAAHDsE I

21、AAHDsG I A GUS NPTII IAAH 吲哚乙酸水解酶，NAM（ 萘乙酰胺）敏感第六十三张，PPT共七十一页，创作于2022年6月35S Ac转座酶 NPTII IAAHAc TATA GUS NPTII IAAHDsE IAAHDsG I A GUS NPTII 增强子捕获TATA GUS NPTII E E E 外显子I A GUS NPTII 内含子 基因捕获外显子I A GUS NPTII 外显子外显子突变体库构建载体策略第六十四张，PPT共七十一页，创作于2022年6月A、插入突变隐性突变体库构建存在问题第六十五张，PPT共七十一页，创作于2022年6月B、冗余基因的存在第六十六张，PPT共七十一页，创作于2022年6月3.3.2酵