两种陆生植物浸提液对蛋白核小球藻

1、两种陆生植物浸提液对蛋白核小球藻富营养化导致浮游植物尤其是微型藻类过度繁殖而爆发水华 , 引起一系列的环境问题 , 造成巨大的经济损失, 甚至危及人类健康 1-2. 而传统的物理、 化学抑制藻类生长的方法会不可避免地破坏生态平衡并造成环境污染3, 因此寻求一种高效安全的抑藻方法具有重要意义. 利用植物间的化感作用控制水体藻类的繁殖作为一种生物方法, 具有安全不易造成二次污染的优点4-7而备受关注. 化感作用是指包括微生物在内的所有植物间生物化学方面的相互作用 8, 即一种植物通过向环境中释放化学物质影响其它生物生长的现象8-9. 化感作用和化感物质的发现为实现藻类的安全控制提供了一种新思路10

2、. 目前关于植物化感抑制藻类生长的研究主要集中于水生植物 11-15,陆生植物对微藻化感作用的研究相对较少. 合果芋叶和茎含乳汁 , 茎节有气生根; 榕树叶片和气生根中也含有大量的乳汁 , 其中含具有化感作用的单宁和类萜 16-17. 合果芋和榕树两者都能无性繁殖, 较容易获得 , 前者为典型的草本植物 , 后者为典型的常绿乔木, 两者形成较鲜明对比 . 作者曾初步研究了合果芋对富营养化水体中氮、磷的净化效应, 但关于这两种植物的化感作用 , 尤其是化感抑藻作用的研究到目前为止未见报道. 因此本课题选取这两种陆生植物 , 分别探讨了不同种植物以及同种植物不同部位的浸提液对蛋白核小球藻的化感作用

3、 , 以探索不同类型陆生植物对微藻化感作用的差异性及其化感物质的主要存在部位, 从而为陆生植物对微藻化感作用机理的研究提供科学依据.材料与方法材 料浸提液的制备: 合果芋和榕树均采自华侨大学校园内花圃 .取新采集的合果芋茎、合果芋叶、榕树叶、榕树气生根各100 g,置于 80 烘箱中干燥48 h, 用粉碎机粉碎 , 然后用 1 000 mL SE培养基 18 浸泡 , 置于恒温 (25 ) 振荡器中提取48 h, 离心去除残渣，上清液先用普通滤纸过滤，再经孔径为0.22以m滤膜过滤除去颗粒杂质和细菌后 , 得试验用浸提液母液, 浓度为 100gL-1.蛋白核小球藻: 蛋白核小球藻购于中国科学院

4、武汉水生所.试验前将小球藻接种于新配置的SE培养基,使之达指数生长期后用于试验.方 法浸提液抑藻试验方法取浸提液母液，用灭菌过的SE培养基稀释为10、20、30、50 gL-1 4 个浓度梯度, 取处于指数生长期的蛋白核小球藻接种于高温灭菌过的 250 mL 三角瓶内 , 接种后藻液总体积为250 mL.试验设置3个重复,在PYX-250Q-B型人工气候箱内进行,培养条件为温度25 , 光照 3 0004 000 lx, 相对湿度为 70%,光暗比12 h ： 12 h.试验期间每天定时摇瓶 2次，同时随机调换三角瓶放置位置.每天用血球计数板在显微镜(16X40倍)下计藻细胞数 .试验干扰的消

5、除浸提液对蛋白核小球藻的化感作用整个试验过程均在人工气候箱中进行, 能够确保其最适生长温度(25 )和较适的光照条件 (3 0004 000 lx).pH 值作为藻类生长环境的重要理化指标 ,无论在自养或异养条件下都随代谢过程发生变化 . 研究结果表明小球藻能在偏酸性或偏碱性的环境中生长19, 其最适生长的 pH值为6.08.0.试验过程中pH值的变化在6.138.05,因此认为培养基的酸碱度不是限制小球藻生长的主要影响因子. 试验过程中TP、TN浓度变化范围分别为：0.3290.607 mgL-1和1.0162.175 mgL-1,变化幅度较小，这一浓度范围的 MP 均能较好地满足蛋白核小球

6、藻生长的需求; 对试验器皿进行高温灭菌以及浸提液用0.22以m的微孔滤膜过滤除菌，排除了微生物的干扰 , 进一步确定化感作用为抑制藻类生长的主要限制因素.数据处理试验数据采用SPSS13.0软件进行统计分析.化感组分对蛋白核小球藻的相对抑制率计算公式如下 :IR%=(1-N/N0)X100%,其中 ,IR 为相对抑制率;N 为加入化感组分试验组的藻密度(个/mL);N0为对照组藻密度.半效应浓度EC50的计算：用生长面积法20计算96 h EC50;A=(N1-N0)/2 xt1+(N1+N2-2N0)/2 X(t2- t1)+ +(Nn-1+Nn-2N0)/2 X(tn -tn-1),式中

7、,A 为生长曲线以下面积 ;Nn 为 tn 时刻细胞密度;tn 为试验开始后第 n 次计数时间 ;IA 为生长抑制百分率,IA=(Ac- At)/Ac xi00%;Ac为空白组生长曲线以下面积；At为 受试浓度生长曲线以下面积.以 IA 为纵坐标 , 以浓度对数为横坐标作图 ,IA 值为50%所对应的浓度即为EC50值.结果与分析合果芋浸提液对蛋白核小球藻的化感作用合果芋叶浸提液对蛋白核小球藻的化感作用图 1 为不同浓度合果芋叶浸提液对蛋白核小球藻生长曲线和相对抑制率变化情况. 由图 1 可知 , 合果芋叶浸提液前4 d 对蛋白核小球藻的生长具有一定的抑制作用 , 藻密度始终低于对照组且大致随

8、浸提液浓度的增大, 抑制作用增强. 以初始藻密度为2.5 X 106个/mL分别接种于几个浓度梯度浸提液处理组中,试验开始 1 d,10 、 20、 30、 50 gL-1 浓度浸提液对蛋白核小球藻均表现出了抑制作用,藻密度值均低于对照组 4.1 X 106个/mL, 各浓度浸提液对蛋白核小球藻相对抑制率分别为41.5%、51.2%、 52.4%和 75.6%;其后 , 随培养时间的延长, 相对抑制率大致呈下降趋势, 第 4天浸提液浓度为 10 gL-1 和 50 gL-1 处理组藻密度分别为5.4 X 106个/mL和3.5 X 106个/mL,相对抑制率分别为28.9%和 53.9%. 可

9、能是因为浸提液中有效的化感组分不稳定, 在水体中分解转化而浓度降低, 或者其中一部分被小球藻吸收并转化为其同化产物 , 因而对小球藻的抑制效果减弱 ;6 天后合果芋叶浸提液对蛋白核小球藻表现出促进作用 , 大致是浸提液浓度越低促进效果越强.第6天藻密度最大值和最小值分别为21.0X106个/mL(10 gL-1 浸提液组)和 12.9 X 106 个/mL(50gL-1 浸提液组 ), 对应的相对抑制率分别为 -112.1%和-33.3%. 这可能是因为化感组分分解转化后的产物促进了蛋白核小球藻的生长.2.1.2 合果芋茎浸提液对蛋白核小球藻的化感作用图 2 为不同浓度合果芋茎浸提液对蛋白核小

10、球藻生长曲线的影响 (a) 和抑制率的变化情况(b). 由图 2 可知 , 与合果芋叶浸提液相似 , 试验初期 , 茎浸提液对小球藻表现出抑制作用 ,3d 后各浓度浸提液组均表现出促进作用 .以初始藻密度为2.5 X 106个/mL分别接种于几个浓度梯度浸提液处理组中 , 实验开始 1 d,10 、 20、 30、 50 gL-1 浸提液处理组藻密度均低于对照组4.1 X 106个/mL,相对抑制率均达到最大值, 分别为43.9%、 53.7%、 56.1%和 78.0%,与合果芋叶浸提液相似, 随浸提液浓度的增大, 抑制作用增强, 但茎浸提液对小球藻的抑制作用不如叶浸提液持久, 可能是合果芋

11、茎所含的化感物质成分比叶更不稳定. 第 2 天开始茎浸提液的抑制作用逐渐减小 , 低浓度的浸提液相对抑制率均为负值, 表现出促进作用 ,3d 后各浓度浸提液处理组均表现出促进效果 . 与合果芋叶浸提液不同 , 茎浸提液浓度越大, 促进作用越明显. 藻密度最大值和最小值分别为8.9 X 106个/mL(30 gL-1 浸提液组)和6.5 X 106个/mL(50 gL-1 浸提液组)，对应的相对抑制率分别为 -47.1%和-7.4%. 从总的变化趋势来看, 浸提液先表现出抑制作用 , 而后具有促进作用 , 且浸提液浓度越大促进作用越明显 .造成这种现象的可能原因是由于随培养时间的延长, 培养混合

12、液中有效的化感物质浓度逐渐下降 , 对藻类的抑制作用减弱 18,而浸提液中的某些其他成分则可能被小球藻吸收利用 , 为其提供营养 , 浸提液浓度越大, 营养成分越多 , 因而表现出快速增长趋势.2.2 榕树浸提液对蛋白核小球藻的化感作用榕树叶浸提液对蛋白核小球藻的化感作用图 3 为榕树叶浸提液对蛋白核小球藻生长曲线的影响 (a) 和抑制率 (b). 由图 3 可知 , 与合果芋叶和茎浸提液不同 , 除个别情况外 , 总体上榕树叶浸提液对蛋白核小球藻显示了较强的抑制作用 , 且随时间的延长相对抑制率逐渐增大. 浸提液浓度越大抑制作用越强.以初始藻密度为2.0 X 106个/mL分别接种于几个浓度

13、梯度浸提液处理组中 , 试验第 1 天,20 gL-1 浸提液组小球藻密度为2.6 X 106个/mL,与对照组藻密度 2.5 X 106个/mL无 明显差异 (P0.05), 而 10 gL-1 和 30 gL-1 浸提液组小球藻生长受到较强的抑制,藻密度分别为2.05 X 106个 /mL和2.1 X 106个/mL,与对照组差异显著(P6个/mL.第5天相对 抑制率分别达33.8%、 72.5%和 91.3%.图 4 为榕树气生根浸提液对蛋白核小球藻生长曲线的影响(a) 和抑制率变化情况(b). 由图 4 可知 , 除 10 gL-1 浸提液组第 2 天和 20 gL-1 浸提液组第 4

14、 天外 , 各浓度榕树气生根浸提液处理组蛋白核小球藻生长均受到一定的抑制作用 , 但与榕树叶浸提液不同的是气生根浸提液对小球藻的抑制作用不随浸提液浓度的增大而增强 , 作用效果更加复杂,10gL-1 榕树气生根浸提液处理组化感抑制效果较好. 以初始藻密度为2.0 X 106个/mL分别接种于几个浓度梯度浸提液处理组中 , 试验 1 d,10 、 20、 30 gL-1 榕树气生根浸提液组小球藻的生长均受到一定的抑制 , 藻密度均低于对照组4.15 X 106个/mL,相对抑制率分别为 30.1%、47.0%和40.0%.第5 天浸提液浓度10、 20、 30 gL-1 处理组藻密度分别为5.0

15、X105j/mL、1.34 X107 个/mL 和 1.17 X 107 个/mL,抑制率 分别达96.3%、 1.5%和 14.0%.2.3 两种陆生植物不同部位浸提液对蛋白核小球藻抑制效果比较EC5m直与浸提液对藻类的抑制能力成反比,即EC50越小,表. 图 5 为两种陆生植物不同部位浸提液对蛋白核小球藻的EC50,96h值(由于合果芋茎浸提液1 d 后较低浓度浸提液组表现出了促进作用 , 化感抑制蛋白核小球藻的持续时间较短, 未计算EC50,96h 值).由图5可知，合果芋叶浸提液对蛋白核小球藻的EC50,96h值略大于榕树叶浸提液, 说明榕树叶浸提液抑制蛋白核小球藻的效果略好于合果芋叶

16、浸提液; 榕树气生根浸提液对蛋白核小球藻的EC50,96h值大于榕树叶浸提液,说明榕树叶片中起化感抑制作用的化感组分含量多于气生根. 总体上 , 化感作用由强到弱顺序为 ,榕树叶 (EC50,96h 为 13.16 gL-1) 合果芋叶 (EC50,96h为 14.37 gL-1) 榕树气生根(EC50,96h 为 30.66gL-1). 就浸提液对蛋白核小球藻的相对抑制率和蛋白核小球藻生长曲线变化情况综合考虑可以得出合果芋茎浸提液化感抑制作用效果不及合果芋叶浸提液强 , 但差异不显著 ( 对第 1 TOC o 1-5 h z 天后合果芋叶和茎浸提液对蛋白核小球藻的相对抑制率进行t检验 ,P0

17、.05).讨论不同浓度浸提液对蛋白核小球藻化感抑制效果差别较大. 在起抑制作用的期间内, 对于合果芋叶、茎和榕树叶浸提液来说,随浸提液浓度的增大, 浸提液对蛋白核小球藻生长的抑制作用增强 , 表现出浓度效应 . 榕树气生根浸提液较为特殊, 较低浓度浸提液(10 gL-1) 组化感作用抑制效果较好. 镜检观察到投加低浓度榕树气生根浸提液组藻液中含有大量的浮游动物 , 而浮游动物的吞噬作用也是浸提液抑藻的一个重要机制 15. 榕树作为一种重要的药材原料, 许多种成分如黄酮类和内酯类化合物具有抑菌效果 , 过高的浸提液含较多的抑菌成分, 可能又反过来抑制浮游动物的产生和繁殖, 因而较低浓度表现出较好

18、的抑制效果.合果芋和榕树不同部位浸提液对蛋白核小球藻的化感作用试验结果显示, 合果芋叶浸提液对蛋白核小球藻的化感抑制效果比茎略好 , 但差别不明显. 而榕树叶浸提液对蛋白核小球藻的化感作用显著强于榕树气生根浸提液, 这与李锋民等21 的研究结果相似 . 化感物质是植物体内产生的次生代谢物 , 而植物体内的有机物主要在叶片中通过光合作用合成. 试验结果也显示, 榕树叶片浸提液对蛋白核小球藻的抑制作用强于其它部位浸提液, 因此认为化感物质很可能主要是在植物叶片中合成, 然后向下运输至根部释放到环境中后起作用 （ 也可以通过淋溶或挥发作用等方式释放 ）, 但化感组分在从叶片运输到其它组织的过程中 ,

19、 合果芋叶片化感组分较容易运输到茎组织 , 而榕树叶片化感组分相对而言却较难运输到气生根组织 . 两者运输途径存在差异, 但这还值得进一步深入研究 .合果芋叶和茎浸提液对蛋白核小球藻的化感作用呈现先抑制而后具一定促进作用的效果 , 这与门玉洁等18 人的研究结果类似 . 原因可能是: 浸提液化感组分投加到藻类培养基后 , 起作用的化感物质不稳定, 其自身在水溶液中易降解; 或者会被藻细胞产生的抗性物质降解, 甚至被藻细胞吸收转化为微藻能够利用的物质 , 为其提供营养, 因而随培养时间的延长, 培养混合液中起抑制作用的化感组分的浓度逐渐下降 , 对藻类的抑制作用也就逐渐减弱 . 同时 , 其代谢或转化的产物也可能对蛋白核小球藻产生了一定的促进作用 . 与合果芋不同 , 榕树叶和气生根浸提液对蛋白核小球藻的化感作用呈现较为稳定的抑制效果 . 可能是因为榕树叶或气生根组织中含大量的乳汁 , 其中有类萜物质 , 它们对藻类具