蛋白系列试验指导

1、植物淀粉酶活性的测定一、目的：植物中的淀粉酶能将贮藏的淀粉水解成麦芽糖。淀粉酶几 乎存在于所有植物中，其中以禾谷类种子的淀粉酶活性最强。二、原理：由于淀粉酶水解淀粉生成的麦芽糖，可将 3, 5-二硝基水 杨酸还原成3-氨基-5-硝基水杨酸，在一定范围内其颜色的深浅与糖 的浓度成正比，故可求出麦芽糖的含量。以单位时间产生麦芽糖的毫 克数表示淀粉酶活性的大小。三、主要实验材料、仪器和试剂.实验材料：萌发的小麦（芽长1cm左右）。.试剂：（1） l %淀粉溶液（2） 0.4 M NaOH （3） pH5.6 柠檬 酸缓冲液（4） 3, 5 一二硝基水杨酸（5）麦芽糖标准液四、操作步骤.酶液的提取称取

2、5g萌发的小麦种子（芽长1cm左右），放入研钵中加1g石 英砂，磨成匀浆倒入50mL容量瓶中，用蒸储水稀释至刻度，混合均 匀后在室温下放置，每隔5min振荡一次，放置1520min后，3 500 4 000 rpm离心10min,取上清液备用。（注意此处一定留出9mL,用 于酶活性测定!）. （NH4） 2S04分级沉淀粗纯化准确计量酶粗提液体积，在搅拌下慢慢加入（NH4） 2S04到30% 饱和度，静置20min,同上离心。取上清液，量好体积后再加（NH4） 2s04到70%饱和度，静置20min后同上离心，收集沉淀。将沉淀溶于少量洗脱液中，装入透析袋透析过夜。2.淀粉酶活性的测定取1步中所

3、提取制备的酶液5mL,放入100mL容量瓶中，用蒸储 水稀释到100mL。混合均匀后，取4支试管，2支为对照，2支为测 定管，各加入稀释之酶液1mL及1mL pH5.6柠檬酸缓冲液。向对照管中加入4mL 0.4M氢氧化钠，以钝化酶的活性。将测定管和对照管置40C （0. 5C）恒温水浴中保温15min, 再向各管分别加入40c下预热的淀粉溶液2mL,摇匀，立即放入40c 水浴中准确保温10min后取出，向各测定管迅速加入4mL 0.4M氢氧 化钠，以终止酶的活性，然后准备下步糖的测定。3,麦芽糖的测定（1）标准曲线的制作取20mL刻度试管7只，编号，分别加入麦芽糖标准液（1mg/ mL） 0、

4、0,2、0,6、1,0、1,4、1,8、2.0mL,然后用吸管向各管中加蒸 储水使溶液达2mL,再各加3, 5-二硝基水杨酸试剂2mL,将各管摇 匀，置沸水浴中准确煮沸 5min,取出冷却至室温，用蒸储水定容至 20mL,混合均匀，用分光光度计于 520nm波长下进行比色，记录光 密度值（OD520）,以光密度值（OD520）为纵坐标，以麦芽糖含量（mg） 为横坐标绘制标准曲线。表1麦芽糖标准曲线的制作管号1mg/mL麦芽糖标准液 (mL)蒸储水(mL)DNS (mL)光密度值(OD520nm)00.02.02.010.21.82.020.61.42.031.01.02.041.40.62.0

5、51.80.22.062.00.02.0(2)样品的测定取以上各管中酶作用后的溶液及对照管中的溶液各2mL,分别放入20mL具塞刻度试管中.再加2mL 3, 5-二硝基水杨酸试剂，将各管摇匀，置沸水浴中准确煮沸 5min,取出冷却至室温，再用蒸储水定容至20mL,混合均匀，用分光光度计在 520nm波长下进行比色， 记录光密度值(OD520),从表芽糖标准曲线中查出麦芽糖含量 (mg), 然后进行结果计算。4、结果计算淀粉酶总活性(麦芽糖 mg/鲜重g/5min) =(B B.x样品稀释总体积(mL)样品重(g) x CB:在标准曲线上查得的淀粉酶共同水解淀粉生成的麦芽糖量 (mg);B1:在

6、标准曲线上查得的淀粉酶的对照管中麦芽糖量 (mg);C:比色时所用样品液毫升数。淀粉酶的纯化一一凝胶层析一、实验目的：学习凝胶层析的基本原理，掌握凝胶层析的操作方法。二、实验原理：凝胶层析也叫分子筛层析或凝胶过滤，它是以多孔性凝胶材料为固定相，按分子大小不同而分离样品中各个组分的液相层 析方法。分子量大于凝胶孔径的分子无法进入凝胶颗粒网状结构内 部，它会从凝胶颗粒的间隙里通过，而分子量小的分子会进入凝胶颗 粒网状结构内部，因此通过凝胶时比大分子走的路径要长，受到凝胶 的阻力大，因此小分子流出速度慢，大分子流出速度快，从而将分子 量大小不同的物质分开。葡聚糖凝胶是指由天然高分子葡聚糖与其它交联剂

7、交联而成的 凝胶。使用最广泛的就是由 Pharmacia Biotech生产的Sephadex G系 列。根据交联度的不同，Sephadex G有一系列产品，具型号主要有 Sephadex G-1Q G-25, G-50, G-75, G-100, G150和 G-200。 三、实验材料、仪器设备及试剂.实验材料：透析后的淀粉酶粗酶液.实验试剂Tris-HCl 缓冲液(pH7.4) (2)固体(NH4) 2s04 (3) Sephadex G-50 四、实验步骤.凝胶的处理方法：煮沸法.排除气泡.装柱(如用G-50,装柱高度20cm左右)：将层析柱安装好， 除去柱子底部网膜上的气泡，关闭下端的

8、止水阀，在柱子中加入 2-3cm高水层，将活化好的凝胶与蒸储水按照1: 1体积比混成悬浮液，将凝胶悬浮液搅拌均匀后灌入层析柱中，凝胶在重力作用下慢慢沉实，当柱子下端沉实1-2cm左右时，打开止水阀，用玻璃板将柱子 顶部凝胶搅匀，继续加入凝胶悬浮液，直至凝胶柱沉实到所需高度。 凝胶沉实后，注意保持凝胶顶层要一直有溶液， 在凝胶顶层加一层滤 纸片防止凝胶层破坏。.平衡：在滤纸片上面添加1-2cm高水层，接好层析装置，调节 流速0.5mL/min ,先用2倍体积蒸储水平衡洗脱，然后用缓冲液 B平 衡洗涤，直至检测曲线走平为止。.上样：平衡过程结束后，将柱子打开，让凝胶柱面上的溶液自 然流出，当滤纸面

9、水层刚刚没有时，用滴管吸取透析好的样品（1-2mL）,加在柱床面上，等样品进入凝胶后，再加 3-4cm高的缓 冲液，接好洗脱装置。.洗脱：用缓冲液进行洗脱，控制流速为0.5ml/min,用部分收集器收集洗脱液，紫外检测器绘制洗脱曲线。.鉴定：对洗脱峰可以进一步进行 SDS电泳鉴定。五、实验结果与分析：绘制洗脱曲线，分析洗脱峰。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS）一、目的：本实验采用聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳技术，测定淀 粉酶的相对分子质量。掌握电泳技术的原理、方法、装置、凝胶配制 等知识，熟悉主要的操作过程。二、原理聚丙烯酰胺凝胶电泳是以聚丙烯酰胺凝胶作为载体的一种区带电 泳。这种凝胶是以丙烯酰

10、胺单体（Acr）和交联剂N, N-甲叉双丙烯 酰胺（Bis）在催化剂的作用下聚合而成的。Acr和Bis在它们单独存在或混合在一起时是稳定的， 且具有神经 毒性，操作时应避免接触皮肤。化学聚合的引发剂是过硫酸镂（NH4）2S2O3 （Ap）,催化剂是 N, N, N,N-四甲基乙二胺（TEMED）在SDS中，存在三种物理效应，即电荷效应、分子筛效应和浓缩效应。（1）电荷效应：各种酶蛋白按其所带电荷的种类及数量， 在电场作用下向一定电极，以一定速度泳动。（2）分子筛效应：分子 量小，形状为球形的分子在电泳过程中受到阻力较小，移动较快；反 之，分子量大、形状不规则的分子，电泳过程中受到的阻力较大，移

11、 动较慢。（3）浓缩效应：待分离样品中的各组分在浓缩胶中会被压缩 成层，而使原来很稀的样品得到高度浓缩。三、实验材料、仪器和试剂实验材料：透析过的淀粉酶粗酶液试剂：贮液配制方法见下表。表1聚丙烯胺凝胶电泳贮液配制方法配制方法分离胶缓冲液，pH8.9（pH8.9 Tris-HCl 缓冲液）浓缩胶缓冲液，pH6.7（pH6.7 Tris-HCl 缓冲液）分离胶丙胶贮液取48 mL 1mol/L HCl , Tris36.8g,用无离子水溶解后 定容至100 mL。取48 mL 1 mol/L HCl , Tris 5.98g,用无离子水溶解后 定容至100 mL。Acr 28.0g, Bis 0.

12、735g,用无离子水溶解后定容至100（Acr-Bis 贮液 R ）mL,过滤除去不溶物，装入棕色试剂瓶，4c保存。浓缩胶内胶贮液（Acr-Bis 贮液 I ）10%过硫酸俊溶液（Ap）四甲基乙二胺（TEMED）Acr 10g, Bis 2.5g,用无离子水溶解后定容至 100 mL, 过滤除去不溶物，装入棕色试剂瓶，4 C保存。10g过硫酸俊溶于100 mL无离子水中（当天配制）。原液。7 核黄素溶液核黄素4.0mg,无离子水溶解后定容至100mL。8 电极缓冲液，pH8.3 Tris 6 g,甘氨酸28.8 g,溶于无离子水后定容至1 000 （pH8.3 Tris-甘氨酸缓冲液）mL ,

13、用时稀释10倍。9 40%蔗糖溶液10 7%乙酸溶液11 样品提取液，pH8.0（pH8.0 Tris-HCl 缓冲液）12 0.5%澳酚蓝溶液蔗糖40 g,溶于100 mL无离子水中。19.4 mL 36%乙酸稀释至100 mL。Tris 12.1 g,加无离子水1 000 mL,以HCl调节pH 至8.00.5 g澳酚蓝溶于100 mL无离子水中。四、操作步骤.贮液配制（1）配好的贮液用棕色瓶盛装置冰箱内保存，可放 12个月。（2）过硫酸镂应当天配制。（3）如有不溶物要过滤。（4）显色液用前再混和。（5）电极缓冲液用时稀释10倍。.电泳梢的安装将两块玻璃板用去污剂洗净，再用蒸储水冲洗，直立

14、干燥（勿用 手指接触玻璃板面，可用手夹住玻璃板的两旁操作），然后正确放入 硅胶条中，夹在电泳梢里。（1）按表3比例配制分离胶分离胶缓冲液TEMED无离子水取用量（mL）360.300.0615注：TEMED在灌胶前加。将分离胶沿长玻璃板加入胶室内，小心不要产生气泡，加至距短 玻璃板顶端3cm处，立即覆盖2 3mm的水层，静置待聚合（约 40min）,当胶与水层的界面重新出现时表明胶已聚合。（2）按表4比例配制浓缩胶表4浓缩胶取样表名称 浓缩胶缓冲液浓缩内胶TEMED 核黄素溶液 蔗糖取用量（mL）120.0314注：TEMED在灌胶前加。先倒掉分离胶上的水层，立即加入浓缩胶，插入梳子（即样品梢

15、 模板），待胶凝后，小心取出梳子。将稀释10倍的电极缓冲液倒入两 梢中，前梢（短板侧）缓冲液要求没过样品梢，后梢（长板侧）缓冲 液要求没过电极，备用。.样品的制备粗酶液以等量40%蔗糖及1/5体积澳酚蓝指示剂及SDS混和，加 热后，留作点样用。.点样用微量注射器（50L）吸取少量样液，在浓缩胶上层点样，每个 点样梢1550 wL。点样时须小心，防止样品液的扩散。.电泳将电泳梢放入冰箱，接好电源线（前梢为负极）。打开电源开关， 调节电流到20mA左右，样品进入到分离胶后加大到 30mA,维持恒 流。待指示染料下行到距胶板末端 1cm处，即可停止电泳。把调节 旋扭调至零，关闭电源，电泳约 3h。.

16、剥胶取出电泳胶板，去掉胶套，掀开玻璃，去掉浓缩胶，用玻棒协助 将分离胶放到大培养皿中，用蒸储水反复冲洗。.染色、记录结果染色液：考马斯亮蓝 G250染色1小时后，倒掉染色液，重新加 入7%的乙酸溶液脱色，每隔3-4小时更换一次脱色液，观察记录酶 谱，绘图或照相。蛋白质免疫印迹一实验目的学习蛋白质免疫印迹的基本原理、方法与步骤。二实验原理Western Blot （蛋白质印迹或免疫印迹）技术，以蛋白质为检测对 象，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。实验采用聚丙烯酰胺凝 胶电泳（PAGE）将样品蛋白质分离，再转移到固相载体（PVDF尼 龙膜或NC膜）上；固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且保持

17、电 泳分离的多肽类型及其生物学活性不变；然后以固相载体上的蛋白质 或多肽作为抗原，与其对应的抗体（一抗）发生免疫反应，特异性一 抗再与和酶耦联的第二抗体反应，最后在酶的作用下，导致底物显色 或化学发光显影，来检测电泳分离的特异性目的靶蛋白。蛋白质印迹技术结合了凝胶电泳分辨力高和固相免疫测定特异性 高、敏感等诸多优点，能从复杂混合物中对特定抗原进行鉴别和定量 检测。三主要试剂. SDS试齐 I。.固相载体：PVDF尼龙膜或NC膜（硝酸纤维素薄膜）。.转膜缓冲液：甘氨酸 2.9g; Tris 5.8g; SDS 0.37g 甲醇 200ml; 加 ddH2O 定容至 1000ml （48mmol/

18、L Tris HCl, 39mmol/L 甘氨酸， 0.037% SDS）。. PBS-T（pH7.4）: 0.01mol/L PBS-T（NaCl 8.0g;KCl 0.2g;Na2HPO41.44g; KH2PO40.24g）; 1g 吐温 20,加 ddlO 至 1000m1。.封闭液（5%脱脂奶粉，或者3% BSA,现配）：脱脂奶粉1.0g溶 于20ml的PBS中。.检测目标蛋白质的一抗，酶联二抗。.显色液：二抗上偶联酶所需要的显色底物及其缓冲液。四实验步骤.蛋白质样品的制备与SDS分离.蛋白质从凝胶转移到NC膜上（湿润转移或者半干式转移）（1 ）平衡凝胶：用转膜缓冲液平衡，5minX

19、3次。（2 ）膜处理：将滤纸和NC膜，一同在转膜缓冲液中浸泡 10min。（3 ）转膜：a.转膜装置从下至上依次按黑色多孔垫板、海绵垫，滤纸、 凝胶、NC膜、滤纸、红色垫板的顺序放好，滤纸、凝胶、 NC膜精 确对齐，每一步去除气泡，将两层垫板夹紧。b.将装备好的夹板置电转移梢中，NC膜一侧靠正极，凝 胶一侧靠负极。接通电源，30V过夜，或者80V转移11.5h。转移 时间长短依靶蛋白分子量大小来调节。c.转移结束后，断开电源将膜取出，割取待测膜条做免疫 印迹。.免疫探测 包括被转印到膜上的靶抗原与第一抗体（特异抗 体）反应、与酶标第二抗体（抗抗体）反应，以及用酶相应的底物处10 理后进行靶蛋白

20、(抗原)信号检测。(1)用 PBS-T 洗膜，5minX3 次。(2)加入封闭液(5%脱脂奶粉或3%牛血清白蛋白)，浸泡被 转印膜，4c过夜，或37 C (平缓摇动)反应13h,以封闭转印膜 上一些非特异性蛋白质的潜在结合位点，避免非特异性反应。(3)弃封闭液，用PBS-T洗膜，5minX3次，振荡。(4)将封闭好的转印膜浸入第一抗体溶液(按合适稀释比例)中，4c过夜，或者37c反应3h以上，保持平缓摇动。(5)弃一抗，用PBS-T分别洗膜，10minX3次，振荡。(6)加入辣根过氧化物酶(HP)或者碱性磷酸酯酶(AP)偶 联的二抗溶液适当稀释,室温下反应12h,保持平缓摇动。(7)弃二抗，用

21、PBS-T洗膜，10minX3次，振荡。.显色反应利用酶的底物进行显色，具体操作按照产品说明书进行。 将膜 放入相应显色剂(DAB)中，避光显色至出现条带时放入双蒸水中终 止反应。五注意事项. 一抗的选择是影响免疫印迹成败的主要因素。多克隆抗体结合抗原能力较强、灵敏度高，但易产生非特异性的背景；单克隆抗体识 别抗原特异性较好，但可能不识别在样品制备时因变性而失去了空间构型的抗原表位，且易发生交叉反应。因此，兼有多克隆抗体和单克 隆抗体优点的混合单克隆抗体近年特别被推荐，它是由一组能与抗原11分子中的不同且不易变性的抗原表位结合并不易出现交叉反应的单 克隆抗体混合构成。.如果反应灵敏度不高，可增

22、加凝胶的厚度到 1.5mm （厚度超过 2.0mm时，凝胶转移效率受限）；也可在电泳条带不发生变形的前提 下，尽量提高蛋白样品的上样量。.滤纸/凝胶/转印膜/滤纸夹层组合中不能存在气泡，可用玻璃棒 在夹层组合上滚动将气泡赶出，以提高转膜效率；上下两层滤纸不能 过大，避免导致直接接触而引起短路。.如果出现非特异性的高背景，可观察仅用二抗单独处理转印膜 所产生的背景强度，若高背景确由二抗产生，可适当降低二抗浓度或 缩短二抗孵育时间；并考虑延长每一步的清洗时间。. 一抗与二抗的稀释度、作用时间和温度对检测不同的蛋白要求 不同，须经预实验确定最佳条件。. 一般情况使用0.45区m的NC膜，0.10.2区m的小孔径膜只 适合于分子量小于20kD的蛋白质。. PVDF尼龙膜较NC膜柔软、结实、灵敏度高，易于操作且蛋 白质结合能力强（PVDF膜可结合蛋白质480g/cm2,而NC膜只能