3D皮肤模型与化妆品体外科学评估研究专题讲座课件

1、3D皮肤模型与化妆品体外科学评估研究专题讲座第1页，共48页。21研究背景目录2构建3D皮肤模型3基于3D皮肤模型建立体外替代检测方法第2页，共48页。3研究背景第一部分第3页，共48页。化妆品种类繁多，科学评估是关键超过67万件化妆品产品第4页，共48页。化妆品与皮肤的相互作用：安全与功效第5页，共48页。6传统化妆品毒理学检测项目化妆品安全技术规范所列检测项目原料普通化妆品（非特）特殊用途化妆品易接触 眼睛类 发用产 品易接触 护肤类眼睛类护肤品一般彩妆 眼部彩妆 品品护唇及唇部彩 。育发 妆品染发烫发脱毛美乳健美。急性经口毒性试验急性经皮毒性试验皮肤刺激性/腐蚀性试验眼刺激性/腐蚀性试验

2、皮肤变态反应皮肤光毒性试验鼠伤寒沙门氏菌/回复突变试验体外哺乳动物细胞染色体畸变试验体外哺乳动物细胞基因突变试验哺乳动物骨髓细胞染色体畸变试验体内哺乳动物细胞微核试验睾丸生殖细胞染色体畸变试验亚慢性经口毒性试验亚慢性经皮毒性试验致畸试验慢性毒性/致癌性结合试验第6页，共48页。动物实验不能满足评估需求种属、个体差异造成动物实验不能反映人体结果，不科学每年有大量动物被处死，不人道第7页，共48页。8国际体外替代检测发展先驱3R理念William M.S. RussellRex Burch1959第8页，共48页。9国毒性终点际体外替代检测方法的发展测试方法趋势OECD 接受状态皮肤刺激/腐蚀体外

3、重组人体表皮模型- 皮肤腐蚀OECD 431*体外检测生物膜屏障试验-皮肤腐蚀OECD 435*体外重组人体表皮模型-皮肤刺激性OECD 439皮肤致敏直接肽反应试验(DPRA)OECD 442c (2015)ARE-Nrf2荧光素酶试验法(KeratinoSens)OECD 442d (2015)人类细胞系激活试验 (h-CLAT)OECD 442e(2016)LuSens（角化细胞内ARE受体基因试验）待同行评议IL-8记录细胞试验（IL-8 Luc assay ）同行评议骨髓U937皮肤刺激性试验（U-SENS）同行评议过敏原基因组快速检测(GARD) 试验方法待验证利用皮肤模型分析基因

4、试验（The SENS-IS assay）待验证外周血单核细胞衍生的树突状细胞(PBMDC) ;-重组人体表皮(RhE)中 IL-18的 效力试验;-过氧化物酶 肽反应试验 (PPRA) ;-表皮过敏化分析试验- EpiSensA-第9页，共48页。10毒性终点测试方法OECD 接受状态眼刺激/腐蚀性牛角膜混浊和渗透性试验 (BCOP)OECD 437离体鸡眼试验(ICE)OECD 438荧光毒漏出试验 (FL)OECD 460短期暴露试验 (STE)OECD 491 (2015)重组人角膜上皮模型试验(RhCE) EpiOcular 角膜模型的眼刺激实验(EIT) SkinEthic眼刺激实

5、验(EIT)（提案） LabCyte 角膜模型（验证中）OECD 492 (2015)微生理仪细胞传感器试验 (CM)2010年提出草案角膜刺激性检测试验（Ocular Irritection）EURL ECVAM 审查三维（3D）半角膜模型蛞蝓粘膜刺激试验国际体外替代检测方法的发展趋势第10页，共48页。11毒性终点测试方法OECD 接受状态皮肤吸收人类离体皮肤吸收试验OECD 428 *光毒性3T3中性红摄取试验重组人皮肤模型试验（开发中）OECD 432*遗传毒性/致突变细菌回复突变试验OECD 471*体外哺乳动物染色体畸变试验OECD 473*体外哺乳动物细胞微核试验OECD 487

6、*体外哺乳动物细胞Hprt和xprt基因突变试验OECD 476 (原1984年采纳的 476于2015年被分为两个方法：476 和490.)体外哺乳动物细胞胸苷激酶基因突 变试验OECD 490 (2015)重组3D皮肤模型的微核试验和彗星 试验计划2016年完成验证。人类表皮模型的微核试验计划2016年提交法规认可申请。国际体外替代检测方法的发展趋势第11页，共48页。欧盟法规EC1223/2009规定：2009年立法禁止化妆品动物实验和禁止销售经过动物实验的化妆品原料2013年3月11日起全面实施欧盟率先立法全面禁止动物实验第12页，共48页。其他国家相继立法禁止动物实验欧盟*以色列*印

7、度*新西兰加拿大美国巴西澳大利亚韩国阿根廷中国日本俄罗斯中国台湾实施化妆品动物试验/销售禁令的市场（* 全面禁止）积极开展“终止动物残忍”活动的国家着手立案化妆品动物试验/销售禁令的市场Rule 148-C动物福利修正法案终止残忍化妆品法案道德的化妆品法案动物试验法EC1223引自HSI第13页，共48页。14中国亟待发展体外替代检测体系化妆品进出口贸易 技术壁垒中国化妆品产业发 展与技术升级新检测技术体系与 市场的发展消费升级与消费安 全的有力保障社会经济的发展 与动物福利保护法规与标准的发展建立国家竞争力第14页，共48页。15化妆品新原料/配方传统方法新技术 新模型体外检测 方法皮肤细胞

8、培养3D模型构建器官芯片技术化学风险评估微生物风险评估动物毒理评估基因水平蛋白水平细胞组织水平人体评估化妆品体外科学评估体外替代检测是中国化妆品产业发展的技术支撑第15页，共48页。16构建3D皮肤模型第二部分第16页，共48页。3D表皮模型 EpiKutis含毛囊皮肤模型 FolliKutis3D全层皮肤模型FulKutis含血管皮肤模型EndoKutis3D黑素皮肤模型 MelaKutis含脂肪皮肤模型 AdipoKutis3D角膜上皮模型BioOcullar3D口腔上皮模型EpiOriis完成系列化3D重组模型的开发第17页，共48页。结构与中国人皮肤高度一致，测试与临床结果高度一致成功

9、开发国际第一个中国人3D皮肤模型3D皮肤模型：EpiKutis人体皮肤第18页，共48页。3D皮肤模型（ EpiKutis ） 高度接近于天然皮肤H&ELORFLGCK10使用中国人角质形成细胞为种子细胞具有正常皮肤组织学结构、表达早期分化蛋白（CK10）晚期分化蛋白（FLG、LOR）第19页，共48页。实现3D皮肤模型（ EpiKutis ）的规模产业化攻克3D皮肤模型大规模、标准化生产的国际难题 建成中国领先的3D皮肤模型产业化平台大规模细胞培养大规模3D组织构建发生器第20页，共48页。21基于3D重组模型 建立体外替代检测方法第三部分第21页，共48页。22利用3D皮肤模型获取多维度测

10、试数据基因表达组织结构细胞因子组织活力第22页，共48页。体外皮肤刺激性检测第23页，共48页。24体外皮肤刺激性检测体系Marker: 药物曝露后的组织活力; Model: 3D重组皮肤模型(EpiKutis); Method: MTT组织活力检测;3 min30 min2 hrs4 hrs8 hrs16 hrs24 hrs中等刺激性轻微刺激或无刺激性OECD 439GHS 2OECD 431GHS 1EPA IEPA II腐蚀性重度刺激性EPA IIIEPA IV药物曝露时间与刺激性强弱关系Time to toxicity第24页，共48页。25基于3D皮肤模型皮肤刺激性（SIT）的检测流

11、程给药DPBS清洗以阴性对照为100%计 算组织活力值给药组OD% =阴性对照OD异丙醇浸提酶标仪读数Followed OECD TG 439后孵育第25页，共48页。26多时间点暴露（）Exposure with multi time pointsFollow Time-to-Toxicity （ET50）Viability is presented relative to negative control tissue valuesTest Material OD% =Negative Control OD清洗Wash offMTT反应MTT reactionOD值读取 OD readin

12、g化妆品的微弱刺激性检测方法（Time-to-Toxicity）第26页，共48页。SIT法不适用于判定化妆品的微弱刺激性SIT is not good enough to predict the weakness of skin irritation体外皮肤刺激性（Time-to-Toxicity）方法能有效判断化妆品配方的微弱刺激性第27页，共48页。体外皮肤刺激性（Time-to-Toxicity）方法 在防腐体系筛选中的作用样品编号ET50（h）HSY-1ET50 =11 hHSY-2ET50 24 hHSY-3ET50 =12 h三个配方很接近，但是防腐体系不一样！防腐体系1：0.6

13、%（苯氧乙醇+乙基己基甘油）+ 40%甘油 防腐体系2：0.35%辛甘醇+ 40%甘油防腐体系3：0.6%苯氧乙醇+ 40%甘油 防腐体系4：0.2%苯甲酸钠+ 40%甘油防腐体系5：0.6%（苯氧乙醇+乙基己基甘油）+ 0.35%辛甘醇+ 40%甘油防腐体系6：0.6% 苯氧乙醇 +0.2% 苯甲酸钠+ 40%甘油 防腐体系7：40%甘油第28页，共48页。体外皮肤屏障功效检测第29页，共48页。30消除炎症级联反应remove the inflammation cascade第30页，共48页。31皮肤角质细胞形态与皮肤屏障及 肌肤敏感状态高度相关Corneocyte is highly

14、related to skin barrier functionrCE60%rCE30%Basing on over 5000 cases of corneocyte morphology analysis (Tape-stripping), as compared with consumer evaluation.Rigid CorneocyteSample：Tape Stripping/BioCell R&D data第31页，共48页。32NativeskinHD dermatitisThe lower ceramide(EOS)and higher FFA may explain de

15、creased skin barrier function in HDD patients.Sample：Tape Stripping/BioCell DATA Method：HPLC-ELSD皮肤屏障脂质（CER）与皮肤屏障及 肌肤敏感状态高度相关Ceramide is highly related to skin barrier function第32页，共48页。33keratinocytesLipidFilaggrin(Permeability): Lipid andCE, Cell adhesionsomesynthesisCorneodeLoricrin皮肤屏障的构成与指标确定 D

16、etermination of skin barrier related biomarkersCornified EnvelopeSkin LipidCell JunctionCytoskeletonOthers Filaggrin HMG-CoA reductase Occludin Keratin 1 Aquaporin 3 LoricrinSkAicnetbyla-CrorAiecrarboxylaseCColarundiinfi1edkCelaruadtinin4o/7cytes Keratin S5 kin barrier C(Pashpayssei1c4al): Involucri

17、n SeNrinMe pFalmitoyl transferase ZO-1 ZO-2 ZO-3 Keratin 10 Fas Transglutaminase 1 ABCA12 JALMat-1e differentiating Keratin 14 FasL Transglutaminase 3 extrusionPPAR- crosslink Desmokgelerian t1inocytes Keratin 1sm6 osome Csaysnptahsees8is Transglutaminase 5 PPAR-ss Desmocollin 1 Keratin 17 IL-1 Smal

18、l-proline-richprotein 2ALipid PPAR- Filaggrin EE-caadrhlyeridnifferentiating Keratin 2Desmo-InILv-o6lucrinsynthesissynthesis ABCA1 Gap junction protein,alpha 1 Keratin 6 IL-8 Integrin alpha3/6; beta4/5 Keratin 11Proliferating keratinocytes TNF确定了 200多种与皮肤屏障高度相关的基因第33页，共48页。34NoNoYesNoYesSample Reque

19、stMTTIC50/Proliferation/MorphologyBio-Markers Gene Expression Assay2D Normal Keratinocytes ModelEfficacySkincare Cytokines ELISAHigh Potential ActiveYesElisa & Western Blot Protein Assay ConfirmingSummarizationTissue ModelCell MigrationScratch TestConfirmation 3 Optimal Conc.100%+ Cell ViabilityYesD

20、eterminationOptimal Working Conc.Working Conc. AdjustingEnsure Viability and MorphologyNo2D UVBDisrupted Model 2D Normal Keratinocytes Model2D3D第34页，共48页。357.0006.0005.0004.0003.0002.0001.0000.0008.0009.000LORTGM1HMGCRACACASPT ABCA12FLGCASP14OCLN1 CLDN1DSG1K16ControlExperiment#2促屏障相关功效基因表达分析（2D）Acti

21、ve candidates upregulate skin barrier related gene expression第35页，共48页。36促屏障相关效应物质的表达（3D）The advantage of skin barrier test with 3D skin modelsBiomarker only exist in 3D (SC)NMF in SC;Lipid in SC;CE protein and structure；Penetration barrier；第36页，共48页。37Blank Control样品2 20ppm样品X 20ppm根据染色区域的光密度平均值，样品

22、增加FLG表达约30%促屏障相关效应物质的表达（FLG）第37页，共48页。380.00002.00004.00006.00008.000010.000012.000014.0000正常2#1.60001.40001.20001.00000.80000.60000.40000.20000.0000正常2#NMF:PCANMF:UCA胰酶下底面降解1h2h促屏障相关效应物质的表达-NMF第38页，共48页。39皮肤美白活性物、配方 的整合评估方案In vitro evaluation of skin whitening efficacy第39页，共48页。Keratinocyte-derived

23、 factors that regulate skin pigmentation胞吐作用胞吞作用膜泡运输成纤维细胞生长因子肝细胞生长因子干细胞因子粒单集落刺激因子神经生长因子内皮素前列腺素白血病抑制因子黑色素皮质素受体突触蛋白酶激活受体皮肤黑素合成与美白的机理第40页，共48页。41反面高尔基体网蛋白质转换酶核内体溶酶体黑素小体原纤维蛋白 具膜小泡黑素亲和素肌球蛋白多巴色素异构酶丝状肌动蛋白 微管驱动蛋白动力蛋白多巴受体黑色素皮质素受体促黑素促肾上腺皮质素角朊细胞Factors that affect skin pigmentation within melanocytes皮肤黑素合成与美白的

24、机理第41页，共48页。42传统检测方法100806040200120 Tyrosinase activity %*ControlNAKAArbTyr activity in melanocytes(4.0)4.03.02.01.00.0(1.0)(2.0)(3.0)Control-MSHNAKAArbmRNA fold change (lg)MITFgp100TYRRab27aTRP2MC1RMelanin synthesis related gene expressionInhibition of melanin amountPositive controlActivesInhibitio

25、n of melanin transfer（Rab27a）第42页，共48页。43美白功效体外整合评价体系Degree 3Degree 2Degree 1MelaKutis黑素皮肤模型第43页，共48页。443D黑素皮肤模型（MelaKutis）GP100特异性地表达于表皮基底层的黑素细胞中。 表明该模型具有正常的黑素合成响应能力。Masson-Fontana染色结果表明，模型具有正常 的黑素合成能力，合成的黑素转运到表皮细胞中。第44页，共48页。45TA3TA5ControlUVBTA7TA-1TA-2KA-1KA-2377-1377-2NA-1NA-2VC-1VC-2VP-2VP-1Co

26、ntrolUVB活性物或配方表面给药与评估第45页，共48页。UVB=1表面给药低浓度UVB=1表面给药高浓度绝对值相对值Mela/L*绝对值相对值Mela/L*L值黑素含量L值黑素含量L值黑素含量L值黑素含量UVB45.30046.228100.000100.0011.000UVB45.30046.228100.000100.0011.000VC-磷酸酯钠59.36743.669131.05294.4650.721VC-磷酸酯钠53.46742.243118.02891.3790.774VC-乙基醚55.60039.656122.73785.7830.699VC-乙基醚56.00041.689123.62090.1820.730烟酰胺54.43344.420120.16296.0890.800烟酰胺58.16740.403128.40387.4000.681曲酸59.10038.611130.46483.5