动物免疫学实验技术-免疫酶技术

1、PAGE PAGE 19 第十二章 免疫酶技术(Immunoenzymatic technique)一、概述原理 免疫酶技术是近代发展起来的一项新的免疫技术。它是把抗原抗体的免疫学反应与酶的高效催化作用原理有机地结合起来，即把具有催化活性的酶类通过化学的方法和抗体(或抗原)结合起来成为酶标记物。这种酶标记物同时具有免疫学反应性和化学反应性，将其与待测的抗原或抗体结合，通过酶的活性降解底物呈现出颜色反应从而显示出该免疫学反应的存在。酶的活性与底物以及与显色反应呈一定的比例关系。显色越深，说明酶降解底物量越大，与酶标抗体(抗原)相检测对应的抗原(或抗体)量也就越多。（二）免疫酶的分类与特点1分类2

2、免疫酶技术的特点 灵敏度高，可与放射免疫相比，检测能力可达ng水平。 应用范围广，既能检测抗体又能检测抗原，既能定性又能定量、定位及抗原分析。免疫荧光技术、放射免疫技术和免疫酶技术的应用比较见表121表121免疫酶技术、免疫荧光和放射免疫技术的比较定性定量定位抗原分析免疫荧光技术免疫酶技术放射免疫技术 不需要特殊设备，放射免疫需要特殊的实验室条件，免疫荧光法需要荧光显微镜。 标本可长期保存。 酶标记物有效时间较长，一般低温保存可达一年以上。（三）常用标记酶及其底物1标记酶的选择条件 活性高，分解底物的能力强。 特异性强，即作用于底物的专一性强。 与抗原抗体结合后仍保持酶的活性。 与底物作用可以

3、显色。 纯度高、易纯化，即含杂蛋白少。 可溶性(水溶性)好，在溶液中稳定。 测定方法简单。 酶来源方便、价格低廉。2符合条件的酶 辣根过氧化物酶(Horseradish peroxidase HRP)，分子量40 000。 碱性磷酸酶（Alkaline phosphatase AKP），分子量82 000。 -半乳糖甙酶（-galactosidase），分子量540 000。 葡萄糖氧化酶（glucose oxidase）,分子量186 000。其中以HRP最为常用，因其具有活力高、稳定、分子量小、易提纯等优点。3辣根过氧化物酶 HRP广泛地分布于植物界，以辣根中含量最高。它是由无色的酶蛋白和

4、棕色的铁卟啉辅基组成的一种糖蛋白，含糖量18%，它由300个氨基酸和4个二硫键连接而成。分子量40 000，等电点5.59.0之间，它催化的最适pH因供氢体不同而有所差异，但多在pH5.0左右。HRP易溶于水和58%以下的饱和硫酸铵溶液。HRP酶蛋白和其它杂蛋白的最大吸收光谱为275nm，辅基部分的最大吸收光谱为403nm，二者比值OD403/OD275为酶的纯度。以RZ值(Reinheit Zabl德文)表示。RZ3为高质量，RZ2.5为中等质量，RZ2.5则需要纯化。RZ值越小，表示杂蛋白越多,如RZ为0.6，则表示有75%的杂蛋白。衡量酶质量的标准有两条，一个是纯度即RZ值，一个是活力。

5、只用酶的纯度表示是不全面的。目前国际上规定,酶的活力以国际单位表示。一个酶单位是在一定的条件下(pH、温度和底物浓度)一分钟能降解1mMol/L底物的酶活力。1mg酶所含有酶的单位数称为比活性。用比活性进行酶的比较。用作标记的过氧化物酶活性一般要大于250units/mg。4HRP的作用底物与供氢体 底物为H2O2，催化时需供氢体。 组化法常用的供氢体是3，3二氨基联苯胺盐酸盐(3.3diaminobenzidine . DAB)。其反应物由于形成的氧化型中间体迅速聚合，形成不溶性的棕色吩嗪衍生物，可用于光学显微镜观察。这种多聚物能还原和螯合四氧化锇(OSO4)形成具有电子密度的产物，可适用于

6、电子显微镜观察。 用于ELISA的供氢体有下列数种。见表122。表122 ELISA的供氢体供 氢 体反应颜色波长终止剂终止颜色测定波长联大茴香胺(OD)桔红5125Mol/L HCI黄400邻苯二胺(OPD)黄4442Mol/L H2SO4桔黄492邻苯甲苯胺(OT)兰6362Mol/L H2SO4黄4425氨基水杨酸褐4751Mol/L NaOH褐449以OD和OPD最为常用。OPD有致癌作用，使用时需注意。5碱性磷酸酶 可从小牛肠粘膜或大肠杆菌中提取。它是一种磷酸脂酶,其作用是催化磷酸脂水解释放出无机磷酸而显色。或者通过水解产生的磷酸与钼酸反应生成磷钼酸，然后在还原剂作用下生成蓝色的产物

7、进行测定。二、酶标记抗体的制备技术（一）酶标抗体的条件1纯度高、含杂蛋白少,用IgG优于血清抗体，用Fab优于IgG。2特异性强 即抗IgG与IgG在免疫电泳上只有一条沉淀线,与IgG的全血清也只有一条沉淀线,这才算是特异性的单价抗体。3效价高 一般琼脂扩散鉴定为164以上才算合格。（二）酶标记方法1交联法 交联法通常用的交联剂是戊二醛，戊二醛商品大多为25%的水溶液，利用戊二醛分子上对称的两个醛基，分别与酶和蛋白质分子中游离的氨基、酚基等以共价键结合而进行标记。标记时应尽量采用新鲜纯品，当戌二醛的OD235nm/OD280nm3时，即为好的交联剂。戊二醛交联法又分为一步法和二步法。 一步法：

8、即把酶、戊二醛和抗体一起加入进行交联。然后透析出过量的戊二醛而制备出具有高分子量的酶结合物。由于抗体分子量大(16万)，酶分子量小(4万),抗体分子的氨基数比酶蛋白分子氨基数多得多，结果生成的抗体戊二醛或抗体戊二醛抗体多而造成酶标物的活性小。一步法操作：抗IgGAKP的制备：将10mgAKP溶于含有5mg抗IgG的1mlPBS(0.01Mol/L pH7.0)中，在冰浴中缓缓搅拌，尽量避免气泡产生，完全溶解后，缓缓滴加1%戊二醛溶液4ml，使戊二醛的最终浓度为0.2%，移至室温中静置2h3h后，以0.01Mol/L pH7.0 PBS液4充分透析或以SephadexG25柱除去过量的戊二醛，4

9、保存备用(也可保存于50%甘油中置低温冰箱)；抗IgGHRP的制备：将12mgHRP溶于含5mg抗IgG的1mlPBS(0.1Mol/L pH6.8)中,缓慢搅拌下加入1%戊二醛溶液4mL，置室温2h3h，充分透析或以SephadexG25除戊二醛，小量分装后保存于低温冰箱，避免反复冻融。或冷冻干燥保存。 二步法：是先使酶与戊二醛反应,除去未反应的戊二醛，再使已“活化”的酶分子与抗体分子的氨基结合，最后加入少量的赖氨酸封闭被戊二醛激活的酶的残基。二步法操作：将10mg的酶溶于0.2ml含1.25%戊二醛的0.1mol/L pH6.8 PBS中室温放置18h，充分透析或以SephadexG25柱

10、除去未反应的戊二醛。加生理盐水至1ml然后加入1ml(含5mg)的抗体溶液和1ml 1Mol/L pH9.6碳酸盐缓冲液，混合后4冰箱放置24h，加入0.1ml 0.2mol/L赖氨酸，置室温2h，以0.15Mol/L pH7.2 PBS液充分透析，离心去沉淀，上清液即为酶结合物，再进一步以硫酸铵沉淀纯化后应用。AKP一般不采用二步法,而只用一步法。改良HRP二步标记法：取HRP10mg溶于0.4ml,0.25Mol/L pH6.8PBS液中或0.05Mol/L pH9.6碳酸盐缓冲液中，加入25%戊二醛0.1ml，37温育2h后加入冰冷的分析纯的无水乙醇2ml，2 500r/min离心沉淀1

11、0min15min，倾去溶液。沉淀以80%乙醇4ml5ml混悬，同上离心，倾去乙醇，将管倒置，使乙醇充分流出。沉淀用1ml 0.05Mol/L pH9.6碳酸盐缓冲液溶解，加入0.5ml1ml 抗IgG抗体溶液(含抗体15mg左右)，放在冰箱内过夜后，加KH2 PO4，使近中性即可应用。2氧化法 采用过碘酸钠，过碘酸钠是强氧化剂，能将HRP的甘露糖部分(与酶活性无关的部分)的羟基氧化成醛基，然后与抗体的氨基结合,形成酶标抗体。（1）氧化法操作过程如下：将5mgHRP溶于新配制的1ml 0.30Mol/LpH8.1重碳酸钠中，加0.1 ml 1%氟二硝基苯(FDNB)无水乙醇溶液,在室温中混合后

12、，再加入1ml 0.04Mol/L0.08Mol/L过碘酸钠(NaIO4)，置室温中轻搅30min，在溶液呈黄绿色时，加1ml 0.16Mol/L乙二醇溶液，在室温中放置1h，使氧化反应中止，然后在4中对0.10Mol/L pH 9.5重碳酸钠缓冲液透析，换液3次。在3ml HRP醛基溶液中，加入5mg(溶于1ml的碳酸盐缓冲液中)，室温置2h3h，加入5mg氢化硼钠(NaBH4)，于4冰箱放置3h或过夜，然后用PBS液充分透析，离心去沉淀物。上清液即为酶结合物，纯化后使用。（2）改良过碘酸钠法：取5mg HRP溶于0.5ml双馏水中，加入新配制的0.06Mol/L NaIO4水溶液(10ml

13、双馏水128mg NaIO4) 0.5ml，混匀，置430min； 取出后加入0.16Mol/L乙二醇水溶液(10mlH2O+0.09ml乙二醇)0.5ml，室温放置30min；加入含5mg纯化抗体的水溶液1ml，混匀，并装入透析袋，对0.05Mol/L pH 9.5碳酸盐缓冲液缓缓搅拌透析6h(或过夜)，使之结合；加入NaBH4溶液(5mg/ml)0.2ml，混匀，置42h；在以上溶液中缓慢加入等体积的饱和硫酸铵溶液，混匀，430min，离心，去上清，沉淀以少许0.02Mol/L pH7.4 PBS液溶解，装入透析袋，以同样液体在4透析除盐过夜；次日取出离心，以除去不溶物，即得酶抗体(HRP

14、IgG)结合物，以0.02Mol/L pH 7.4 PBS液加至5ml；效价测定合格后，加入等量优质甘油，分装小瓶，低温保存。戊二醛交联法与过碘酸钠氧化法比较，见表123。表123 戊二醛法与过碘酸钠法比较比较项目戊二醛法过碘酸钠法一步法二步法标记方法简单较复杂较复杂酶利用率24%24%70%酶偶联到99%抗体上产率5%5%50%标记抗体分子量750万25万40万穿入组织能力差好一般抗体活性丢失多少较多酶活性丢失多少较多染色效应差较好较好3二马来酰亚胺法 二马来酰亚胺(Dimaleimide)能与蛋白质半胱氨酸的硫基反应。首先用巯基乙胺还原蛋白质(IgG),并用N、N苯二马来酰亚胺活化，然后除

15、去多余的试剂，最后使含二马来酰IgG与含硫基的半乳糖苷酶连接。具体操作如下：将抗lgG抗体溶于0.1Mol/L pH5.0醋酸钠缓冲液并对同一缓冲液透析平衡过夜,离心除去不溶性物质,抗IgG(14mg/2ml)与10ml巯基乙胺在37温育90min。过Sephadex后浓缩使每ml含3.0mg左右的还原抗IgG。在0中,按11滴加饱和N、NO苯二马来酰亚胺溶液，混合，于30温育20min，过SephadexG25柱，除去未反应的二马来酰亚胺。收集二马来酰亚胺“活化”的抗IgG,浓缩使浓度为OD280nm=1.0(光径1cm),取1ml溶液加20l(5mg/ml)半乳糖苷酶，置3020min，用

16、0.10Mol/L NaOH中和后，于4置24h72h，再过Sepharose-6B柱(1.540cm)，以pH7.0PBS洗脱,收集酶结合物，加叠氮钠(NaN3)防腐，4保存备用。酶标抗体结合物的纯化 在酶标记的溶液中，出现的是各种交联物的混合物,有酶抗体、酶抗体酶、抗体抗体、酶酶，甚至还有游离的酶和抗体。在这中间,除了抗体酶和酶抗体酶外,其它都应该给予除去。150%饱和硫酸铵沉淀法。 此法只能除去游离的酶及酶酶聚合体。而不能除去其它不需要者。但是此法对酶标抗体的损耗少。2过SephadexG200或Sepharose6B柱。此法较繁琐,而且对酶标抗体的损耗较大,但提纯的质量好。（三）酶标抗

17、体的鉴定1酶标抗体的活性鉴定 一般以琼脂扩散和免疫电泳进行鉴定。使酶标抗体和相应的抗原(抗原浓度为1mg/ml)产生沉淀线,洗涤后于底物溶液中显色,显色后用生理盐水漂洗,沉淀线不褪色,说明酶和抗体都具有活性。良好的酶标结合物琼脂扩散滴度一般应在1：16以上。2酶结合物的定量测定 包括酶量、IgG含量、酶与IgG克分子比值以及结合率的测定。酶量(g/ml)=OD403nm0.42 （1）戊二醛法：IgG(mg/ml)=(OD280nmOD403nm0.42)0.940.62(OD4030.42为酶在403nm的光密度，抗体与酶戊二醛结合后OD280nm约增加6%，所以乘以0.94校正。由于兔Ig

18、GOD280nm=1.0时为0.62mg，所以又乘以0.62)。（2）过碘酸钠法：IgG(mg/ml)=(OD280OD4030.30)0.62(40 000和160 000分别为辣根过氧化物酶和IgG的分子量)。 酶结合率=结合物中的酶量/标记时加入的酶量100%。 酶标记率：OD403nm/OD280nm即酶中正铁血红素辅基的吸光度(403nm)与抗体酶蛋白中的色氨酸、酪氨酸的吸光度(280nm)之比表示HRP在AbE中所占的比例，它与E/Ab克分子比值呈高度正相关。3酶结合物的质量标准 纯化的酶结合物的质量标准应包括以下几个方面。（1）酶的催化活性。（2）免疫学活性。（3）未联接的游离酶

19、的量。（4）未联接的原始免疫反应物的量。（5）每个酶分子所联接的免疫反应物分子数目。（6）生化性质。（7）酶标记免疫试验效果。酶结合物的质量差异,可引起试验敏感度的很大变化。例如用不同的程序制得的HRPIgG结合物进行酶标记免疫试验，可得到不同的试验结果，故应予重视。用于ELISA的各项指标参数见表1240表124 用于ELISA酶标抗体的各项指标参数评价最好好一般酶结合量(mg/ml)1.00.50.4酶结合率(%)309107酶IgG克分子比1.51.00.7（五）酶标抗体的保存分装小瓶，冻干低温保存。也可分装小瓶,在4或0以下保存。加甘油或牛血清白蛋白(最后浓度为33%)保存更好。避免反

20、复冻融。保存期：一般12年活性不变。三、抗酶抗体及酶抗酶复合物的制备抗酶抗体的优点，在于酶和抗体结合时，不需要通过化学交联剂交联，抗体的失活少。在酶复合物形成后，同时就具有酶的活性，遇到相应的底物即呈现催化显色作用。必须注意，抗酶抗体必须用与第一抗体同种来源的动物制备。（一）抗酶抗体的制备于家兔的两个后足掌内各注入弗氏完全佐剂(含活卡介苗12mg/ml)和过氧化物(5mg/ml)的等量混合乳化液0.5ml，两星期后，于两侧腘淋巴结内注入同样液体。一周后静脉注射0.2ml0.4ml，过氧化物酶液(同样浓度), 并同样强化23次,末次注射后一周验血、分离血清即为过氧化物酶抗体。（二）酶抗酶复合物(

21、PAP)的制备1取单价特异性抗酶血清10ml，1.5104r/min(4)离心20min，吸取上清。2于上清液中滴加酶溶液(0.5mg/ml)直至不再产生沉淀,静置1h，1.5104r/min离心20min。3将沉淀物用冷生理盐水125ml洗三次，每次1.5104r/min离心20min。4于冰浴下，将沉淀物悬混于4ml HRP(2mg/ml)中。5在pH计监测下，边搅拌边加0.1Mol/L或0.01Mol/L HCl至pH 2.3。此时沉淀已全部溶解，1.5104r/min离心20min。6吸取上清，用0.1Mol/L NaOH调pH至7.4。7量体积，加入1/10容量的0.075Mol/L

22、醋酸钠和0.15Mol/L醋酸铵的等量混合液。8逐滴加入等体积的100%饱和硫酸铵，搅拌20min。1.5104r/min离心20min。9将沉淀物用50%饱和硫酸铵洗1次，同样离心。10将沉淀物悬混于5ml蒸馏水中，以pH6.75缓冲盐水透析3天，每天换水1次。(缓冲盐水由1.35104ml生理盐水, 25ml 1.5Mol/L醋酸钠和75ml 2Mol/L醋酸铵配成)。111.5104r/min(4)离心20min，吸取上清，于OD280nm和OD403nm测定,计算IgG和酶含量及克分子比值。12按0.1ml分装，-20保存。13应用时从低温冰箱中取出,立即在37水浴中融化。四、免疫酶组

23、化法(猪瘟组化法)（一）材料与试剂1萘酚液 一苯酚 1.00g40%乙醇 100.00ml3%H2O2 0.20ml混合即可,现用现配。2派洛宁液 派洛宁(Pyroming) 0.10g 苯胺(Aniline) 4.00g 40%乙醇 96.00ml3内源性酶抑制剂：0.01%H2O2的0.01%的叠氮钠溶液。1%H2 O2 1.00ml1%Na N3 1.00ml0.015mol/L pH 7.4 PBS液 100.00ml40.05Mol/L pH 7.6 TrisHCl缓冲液A液：0.2mol/L Tris液三羟甲基氨基甲烷 2.43gH2 O 100.00mlB液：0.1mol/L H

24、Cl取A液25ml，B液38.9ml，混合，加蒸馏水至100ml即可。5DAB液(Karnovsky液)0.05Mol/L pH 7.6 TrisHCl缓冲液 100.00ml 3，3二胺基联苯胺盐酸盐 76mg1% H2 O2 0.5ml配后立即使用。60.10Mol/L pH7.4 PBS液。（二）操作方法1猪瘟酶标抗体工作滴度的确定 对组化法来说，最简单的确定工作滴度的方法是将酶标抗体进行一系列的倍比稀释，然后对已知阳性标本片进行染色，以最为清晰的阳性结果的最大稀释倍数或稍提高12滴度作为工作滴度。购买商品猪瘟酶标抗体,则按其说明的工作浓度稀释即可。2待检标本片的制作 取可疑猪瘟病猪尸体

25、或急宰病猪立即剖检，采取肾脏、脾脏、淋巴结等脏器进行触片(或涂片)或冷冻切片(4m厚度)。余下组织低温冰箱保存或放于盛有50%甘油盐水中于普通冰箱保存，以备复检或比较用。也可采病猪之血作血球粥片。标本片干后，立即以4的丙酮液固定15min。固定后的标本片可贮藏于4冰箱中备用。3染色方法 采用单染法和复染法均可，萘酚复染法操作过程： 苯酚液染色4min5min。 0.015Mol/L pH7.4 PBS液冲洗10min。 派洛宁液染2min。 PBS冲洗后，用吸水纸吸除水滴。 滴加工作浓度的酶标抗体液，以复盖为度，置湿盒内37温育30min45min，PBS液冲洗。 加DAB液室温染色30min

26、； PBS液冲洗后，馏水中漂洗； 干燥后，无水酒精脱水5min，二甲苯透明5min，加拿大胶封片。DAB单染法： 滴加内源性酶抑制剂30min。 0.015Mol/L pH 7.4 PBS冲洗液10min。以下步骤同复染法。2对照组的设置：首次染色时,应设立如下对照。 已知阳性标本的对照。 已知阴性标本的对照。 抗体抑制试验对照，即在标本上加有与酶标抗体来源不同的另一个体的抗猪瘟抗体处理(37作用45min)。再以酶标抗体染色应为阴性。 DABH2O2底物染色对照，即不加酶抗体，只加DABH2O2液。以检查内源性酶被抑制的情况。（三）结果判定在对照组成立的前提下，萘酚复染法：在细胞浆内酶标抗体

27、抗原复合物呈黄褐色,内源性酶被染成红色,背景为浅棕色；单染法：在细胞浆内，酶标抗体抗原复合物呈黄褐色,背景成淡黄色或无色。（四）注意事项1标本必须新鲜，否则非特异性反应重。2固定剂的选择应以不影响抗原的活性又不妨碍抗体进入细胞为原则。病毒标本的固定剂一般选用冷甲醇和丙酮。3消除内源性酶的办法： 以0.303%H2O2液室温处理标本15min30min； 0.10%苯肼37处理1h； 0.074%盐酸乙醇液(100ml乙醇含0.20ml浓盐酸)，室温处理15min。4消除背景染色的办法 背景染色可以是特异性的，因为细胞浆的外溢和炎性浸润造成。但大量的是非特异性的，主要是由于组织成分对免疫球蛋白的

28、非特异性吸附所致，可以采用以下办法消除。 切片以0.303% H2O2作用后,再以10%卵蛋白作用30min。 以0.05%吐温-20和含有0.10%牛血清白蛋白的PBS液预处理。如果采用间接法测定抗原，则可采用下法来消除背景的染色。 以与第一血清不同种类的正常动物血清做预处理。 用来自于酶标记第二抗体的同种动物的血清做预处理,也可用这种血清来稀释第一抗体。5抗体浓度和酶标抗体浓度的确定 直接法测定的酶标抗体浓度是以不同梯度的稀释经过试验而定。间接法测定的第一抗体浓度和第二酶标抗体浓度的确定，则必须进行双方阵试验预以选择。抗体浓度和酶标抗体浓度的确定均不宜过高或过低。过高易出现非特异性反应，过

29、低则影响检出的敏感性。五、免疫酶测定法(ELISA)（一）ELISA实验原理及类型将已知抗体或抗原结合在某种固相载体上，并保持其免疫活性。测定时将待检标本和酶标抗体或酶标抗原按不同步骤与固相载体表面吸附的抗体或抗原发生反应，用洗涤的方法分离抗原抗体复合物和游离物成分，然后加入底物显色，进行定性或定量测定。ELISA可用于检测抗体，也可用于检测抗原。根据检测目的和操作步骤的不同，通常有三种类型的检测方法。1间接法 此法是检测抗体最常用的方法。将已知抗原吸附于固相载体上，加入待测血清(抗体)与之结合，洗涤后，加酶标抗体和底物进行测定。其原理见图121。酶标抗体固相抗原待测抗体EEE图121 ELI

30、SA间接法示意图2双抗体夹心法 此法常用于检测抗原。将已知抗体吸附于固相载体，加入待测标本(含相应抗原)与之结合，温育后洗涤，加入酶标抗体及底物溶液进行测定。见图122。酶标抗体固相抗体待测抗原EEE图122 双抗体夹心法检测抗原 3竞争法 此法可用于抗原及半抗原的定量测定，也可用于测定抗体。以测定抗原为例，将特异性抗体吸附于固相载体上，加入待测抗原和一定量的已知酶标抗原，使二者竞争地与固相抗体结合，经过洗涤分离，最后结合于固相的酶标抗原与待测抗原含量呈负相关。见图123。固相抗体EEE酶标抗原待测抗原E底物E显色反应（弱）固相抗体EEE酶标抗原底物显色反应（强）EEEEEE图123竞争法测抗

31、原示意图（二）ELISA试验条件的选择：1固相载体的选择 载体的种类很多，其中包括纤维素、交联右旋糖酐、葡萄球菌聚苯乙烯、聚丙烯酰胺等。从使用形式上可有凹孔平板、试管、珠粒等。聚苯乙烯凹孔板是应用最广泛的一种载体。聚苯乙烯塑料微量滴定板吸附蛋白的性能好，操作简便、用量小，适于大批检查。由于聚苯乙烯的工艺过程不够稳定,造成各批次差异较大。所以进行ELISA之前，必须进行筛选。检查方法： 吸附性能的检查：先加抗体包被，然后加入同一稀释度的酶标抗体，最后加底物、显色、测OD值,求出总平均OD值,再求出每相邻两孔的OD平均值,此均值在总均值的10%以内为合格,若中间孔与四周孔OD值相差太大，或一侧与另

32、一侧孔OD值相差较大均属不合格。 对比测定阳性血清与阴性血清，观察是否存在明显差异，若二者OD值相差于10倍以上者为合格。板的处理。新板一般不用处理,用蒸馏水冲洗即可应用。板用一次即废。但不少实验工作者认为用超声波处理，清洁液Tritonx100、20%乙二醇处理仍可应用。但发现空白对照显色较深和阳性样品显色结果不理想时，应弃去不用。2载体的吸附条件 载体的吸附均为物理吸附。吸附的多少取决于PH值、温度、蛋白浓度、离子强度以及吸附时间等。较好的吸附条件是：离子强度为0.05Mol/L0.10Mol/L，pH9.0pH9.6碳酸盐缓冲液，蛋白浓度为1g/ml100g/ml，4过夜或373h。3酶

33、标抗体使用浓度的确定 于聚苯乙烯板孔中加足够量的抗体包被,温育一定时间，冲洗、把酶标结合物倍比稀释，每个稀释度加2孔,温育、冲洗、再加底物显色、比色。以OD值为纵坐标,酶标结合物的稀释度为横坐标，制作曲线。找出OD值为1时，相对应的酶标抗体稀释度为最适酶标抗体稀释度。这个稀释度是指在这种条件下的最适稀释度，换个条件就不是最适的了。如1400的酶标抗体稀释度温育6h可与16 400稀释度温育24h结果相同。所以一旦条件确定之后，就不要变更，以保证结果的重复性和相对的准确性。此最适酶标抗体稀释度可做为工作浓度，也可提高半个至一个滴度，但不能提高过高，否则非特异性显色增加。酶标抗体的滴度反映酶标抗体

34、的质量，也可以此比较酶标结合物的优劣。有材料报道认为1320滴度为合格,11 000以上更好。酶标抗体滴度越高，用于工作浓度的稀释倍数就越大，敏感性就越高，非特异性反应就越低。4抗原： 抗原的要求：用于ELISA的抗原必须采用相当纯的抗原，如果含有其它杂质，将与抗原共同竞争固相载体上的有限位置。用于其它血清学反应的抗原不一定能适用ELISA实验，必须经过试验，抗原必须能牢固地吸附于载体上，而不丧失其免疫活性，且可得到有规律的重复的结果。另外在吸附载体后，对加入的各种试剂产生最小的非特异性吸附，即与阴、阳性血清结合差异较大。 抗原效价的测定 可采用单方阵或双方阵试验。单方阵试验：以不同稀释度的抗

35、原包被酶标板，以常规的1200倍稀释的阳性血清加入，再加入酶标抗体、显色、测OD值，以OD值为1.0时，相应的抗原浓度作为使用效价；双方阵试验比较精确，它既能测出抗原的最适浓度又能测出抗体的最适浓度。即将抗原抗体均稀释成不同浓度进行酶标抗体反应，以血清稀释倍数最高的阴、阳性血清的光吸收值差最大的所对应的抗原稀释度为抗原的使用效价。已吸附的抗原的固相载体经冻干或干燥保存很稳定,数月仍不失活。 5抗体 抗体效价的测定同抗原,采用双方阵试验。6清洗液 一般采用0.01Mol/L pH 7.2 PBS吐温缓冲液。吐温是聚氧乙烯去水山梨醇脂肪酸酯，为非离子型的表面张力物质,常做助溶剂。吐温的编号依聚合山

36、梨醇所结合的脂肪酸种类不同而定。吐温20是结合月桂酸、吐温40是结合棕榈酸、吐温60是结合硬脂酸,吐温80是结合油酸等。通常用吐温20加入缓冲液内做为湿润剂,以减少非特异性吸附。也可在PBS缓冲液中加入1%牛血清白蛋白(或10%小牛血清或卵清蛋白),特别在抗原包被以后,以牛血清白蛋白缓冲液再包被一次,而占据孔内剩下位置,这样来减少非特异性反应。7反应时间 抗原与抗体、抗体与酶标抗体反应一般在37 2h3h达到高峰。时间太短,敏感性下降,时间太长,吸附的抗原或复合物(在这个温度下)可能脱落。酶底物反应时间的确定：一般采用15min30min45min。也可以标准阳性血清为准,随时测定其OD值,当

37、达到规定的OD值时,即终止反应。ELISA结果判定及表示法结果判定，分目测法和比色法。结果表示有以下几种：1以“十” “一”表示阳性、阴性。2直接用OD值表示。3用终点滴度表示 即将标本连续稀释,以最高稀释度的阳性反应(如规定大于某一OD值或阴阳性比值大于某一数值)为该标本滴度。4以单位表示 将已知阳性血清做不同稀释进行滴定,以阳性血清的单位数为横坐标,以相对应的OD值为纵坐标,绘制标准曲线。未知样品可根据其OD值从标准曲线上找出单位数,再乘以稀释倍数,即可获得未知样品的单位数。六、猪瘟单克隆抗体ELISA（一）材料及试剂1猪瘟单抗纯化抗原2兔抗猪IgG酶标抗体3猪瘟阳性血清4猪瘟阴性血清14

38、均由指定的生物制品所购买。5ELISA反应板6包被液碳酸钠 1.50g碳酸氢钠 2.93gH2O加至 1 000mlpH值9.67PBS液氯化钠 8.90g磷酸二氢钾 0.20g无水磷酸氢二钠 2.13g加双馏水 1 000ml8PBS吐温洗涤液PBS液 1 000ml犊牛血清 5ml混合即可9底物溶液 0.1Mol/L柠檬酸液柠檬酸 21g双蒸馏水加至 1 000ml 0.2Mol/L Na2HPO4液Na2HPO412H2O 71.6g双蒸馏水 加至 1 000ml pH5.0磷酸盐柠檬酸缓冲液取液 24.30ml液 25.70ml混匀即可邻苯二胺液取液 50ml双馏水 50ml磷苯二胺 20mg30%H2O2 0.15ml待邻苯二胺溶化后再加H2O2，现用现配。10终止液浓H2SO4(98%) 22.2mlH2O 177.80ml（二）