重组生产胶原蛋白的研究进展

1、重组生产胶原蛋白的研究进展论文导读：而且细胞培养过程中的费用是其他细胞类型如酵母和大肠杆菌发酵培养过程花费的5-10倍。所以需要克隆和表达人源胃蛋白酶用于毕赤酵母商业生产重组胶原蛋白。关键词：重组胶原蛋白，酵母，转基因动物和植物，脯氨酰羟化酶原胶原链在翻译后立刻运输到内质网内腔被P4H羟基化，每条a 链大约有100个脯氨酸发生羟基化作用，每个发生羟基化的脯氨酸出现在GlyXY的Y位置。论文大全。例如, 在I型人源胶原蛋白中，羟基脯氨酸与脯氨酸总数的比率大约是0.46 【3】 。如果缺乏羟基化的脯氨酸, 在生理温度下，胶原蛋白根本的螺旋构象是热不稳定的 【4】 。所以生产热稳定性的重组胶原蛋白需

2、要高水平的表达胶原蛋白并且有足够的P4H活性来催化其羟基化。重组胶原蛋白已经在哺乳动物细胞 、昆虫细胞 、酵母 、大肠杆菌 、 转基因烟草 、小鼠 和蚕 中得到表达。在各种重组表达系统中，只有哺乳动物细胞在转染胶原蛋白基因而不转染P4H基因的情况下，可以表达充分羟基化的胶原蛋白 。胶原蛋白在哺乳动物细胞中的表达水平从0.6到20 mg/l不等，在昆虫细胞中最高可以到达40 mg/l 。然而, 这种表达水平对大规模的商业化生产来说太低，而且细胞培养过程中的费用是其他细胞类型如酵母和大肠杆菌发酵培养过程花费的5-10倍。而在其它的重组表达系统中, 遇到的一个普遍问题是宿主细胞不能提供足够的P4H活

3、性来充分羟基化胶原蛋白。一种多基因表达技术已经用来共表达胶原蛋白和P4H，并且已有利用多基因表达技术以毕赤酵母为宿主细胞表达胶原蛋白的报道。2.2在酵母中的表达重组IIV, VII, IX, XIII,XV和 XVIII型胶原蛋白已经在毕赤酵母中与P4H得到共表达 。在商业化生产中，初期III型胶原在毕赤酵母中的表达水平是15 mg/l 。论文大全。通过遗传干预、发酵条件优化、工艺过程开发等方面的研究，现在某些胶原蛋白类型的收率已超过1 g/l。毕赤酵母中表达的胶原并不分泌到细胞外基质而是在细胞内积聚 ，故需要从细胞中提取胶原前体，通过蛋白酶处理转化为胶原蛋白。哺乳动物细胞中, 特异的细胞外金

4、属蛋白酶催化去除胶原前体N-和C-前肽 ，从组织中别离的前胶原通常利用非特异性的蛋白酶如胃蛋白酶来催化完成这种反响。现在生产中应用的都是动物来源的胃蛋白酶，同样会带来动物来源材料的各种弊端，所以需要克隆和表达人源胃蛋白酶用于毕赤酵母商业生产重组胶原蛋白。 毕赤酵母采用在确定化学成分的根底培养基中，分批补料和空气补氧搅拌的模式进行发酵，并以甲醇诱导表达，可以得到很高的菌体密度 (500 g/l 湿菌重)。重组胶原和P4H基因在乙醇氧化酶启动子的控制下进行表达，所以当生物量积累到一定量后，加甲醇以诱导表达。当菌体密度和前胶原都积累到最大量时，停止发酵，从培养基中收集菌体，并以物理方法打碎得到胶原前

5、体，再通过重组人源胃蛋白酶的处理，胶原前体转化为胶原蛋白。通过沉降或过滤的方法将重组胶原蛋白与细胞碎片别离，其他的纯化步骤用来除去可溶性的杂质，最后得到的产物是溶解于0.01 M HCl 中高纯度无菌的重组胶原蛋白。大多数毕赤酵母中表达的重组胶原蛋白是以单体形式存在的，某些蛋白类型中约510% 共价交联成二聚体，在III型胶原蛋白中还有很少一局部以三聚体形式存在，这是重组胶原蛋白与动物来源胶原蛋白的一个很重要的差异。天然胶原蛋白很大比例以二聚体、三聚体和其他高分子量聚体的形式存在，例如从牛皮中提取的I 型胶原蛋白大约54%是以聚体形式存在的。这样毕赤酵母表达的胶原蛋白就有着更好的匀质性。2.3

6、 转基因系统表达重组胶原蛋白3个转基因系统烟草、小鼠和蚕已经作为有潜力的大规模、低本钱生产重组蛋白的系统开发。在过去的10年中，利用遗传改造的动物和植物生产重组蛋白已经成为事实。植物能够生产和正确组装哺乳动物蛋白，比方包含5个亚基的分泌抗体和病毒颗粒 。利用农业生物技术，结合常规的农学实践与传统的制药业，很小的栽培面积或者很少的动物就能够产生大量的重组蛋白。植物自身能够合成包含羟基脯氨酸的蛋白 ，然而植物细胞中的脯氨酰羟化酶与哺乳动物细胞中P4H有着不同的底物序列特异性 。生产只在GlyXY的Y位置包含羟基脯氨酸的胶原蛋白还是需要共表达胶原蛋白和P4H基因。已经有两个研究小组报道在植物中表达了

7、I型和III型胶原蛋白同型三聚体。转化胶原蛋白全长cDNA序列的烟草细胞，在花椰菜花斑病病毒35S基因组成型启动子控制下，表达了羟基化的III型胶原蛋白 ，这个启动子过去用来调控转染的P4H亚基和亚基cDNAs序列的表达。表达胶原蛋白和P4H的细胞株通过Northern和Western blotting筛选，选择出的烟草细胞在摇瓶中培养, 氨基酸分析重组烟草中获得的III型胶原蛋白含有8.1%的羟基脯氨酸，是组织中纯化的胶原蛋白羟基脯氨酸含量的75%。转化人源pro a1(I) 或者 pC a1(I) cDNA的转基因烟草可以表达和组装全长的三股的胶原蛋白分 。这种未完全羟基化的胶原蛋白从原胶

8、原通过植物自身蛋白酶的作用转化为成熟的胶原蛋白，而且不用胃蛋白酶蛋白水解除去前胶原的N-和C-端前肽。论文大全。这种生产未完全羟基化的胶原蛋白的系统可用来研究三股螺旋的折叠和重组胶原蛋白的物理特性 。在缺少羟基脯氨酸的条件下，三股螺旋也可正确折叠，但是比率非常低。没有羟基脯氨酸的胶原蛋白分子非常柔软，而且溶解温度是30，形成胶原纤维结构也需要不同的条件。已经有报道利用转化37-kb胶原蛋白基因片段和a S1-乳腺酪蛋白特异性启动子基因片段的小鼠的分泌型乳腺产生全长的I型原胶原同型三聚体。鼠乳中有很高含量 (8 mg/ml) 的可溶性原胶原，在胃蛋白酶的处理下转化为I型胶原蛋白同型三聚体(a1)

9、3，但是氨基酸分析发现其中的羟基脯氨酸只有正常水平的50% 。作者推测乳腺上皮组织中P4H 的水平是其羟基化的限速步骤，并且设想再转入编码P4H的a亚基的基因就能克服这种限制。在理论上共转化胶原蛋白和P4H基因的动物能够产生大量的作为重组胶原来源的乳汁，但是这仍然具有动物来源胶原蛋白的种种弊端，其中的隐患依旧没有消除。日本科学家将编码Bombyx mori丝心蛋白L链和人III型胶原蛋白螺旋结构域基因片段的融合cDNA，置于丝心蛋白L链启动子的调控下表达。通过Western blot和胶原蛋白酶酶切实验鉴定，茧中萃取的蚕丝蛋白含有这种融合蛋白。然而，胃蛋白酶消化显示丝腺中并没有组装三股螺旋胶原

10、分子。据推测这是因为腺细胞中内源的P4H的活性偏低造成的。理论上讲，这个问题可以通过共表达胶原蛋白和P4H亚基来解决，就像酵母、昆虫细胞、转基因小鼠中所作的一样。在丝腺中合成胶原蛋白有着很大的开发潜力。据文献，一个蚕茧可以产生大约70mg总蛋白，包含胶原蛋白序列的融合蛋白在抽取的总蛋白中约占3.6% ，这样一个可以养1,500,000条蚕的约300m2的产房一季可以生产5 kg重组胶源蛋白。3小结虽然利用重组表达系统生产胶原蛋白的研究取得了一些进展，但是还有很多问题亟需解决，比方对P4H的共表达技术。相信随着技术水平的进步，新技术平台的不断出现，这些问题也会迎刃而解。在不久的将来，有很大一局部

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