核酸提取及常见问题分析

1、 核酸提取 及常见问题分析TIANGEN BIOTECH(BEIJING)CO., LTD. DNA提取及常见问题分析 RNA提取及常见问题分析讲座内容DNA提取及常见问题分析TIANGEN BIOTECH(BEIJING)CO., LTD. DNA提取的原则 DNA提取的方法 DNA提取常见问题分析DNA提取及常见问题分析 保证DNA一级结构的完整性 排除其它分子的污染 RNA、蛋白质、多糖等DNA提取的原则 DNA提取的原则 DNA提取的方法 DNA提取常见问题分析DNA提取及常见问题分析基因组DNA的提取 CTAB法 SDS法质粒DNA的提取碱裂解法煮沸法线粒体、叶绿体DNA的提取差速离

2、心结合SDS裂解法DNA提取的方法基因组DNA提取主要方法 CTAB法 适用于植物组织，真菌等 SDS法 适用于动物组织，血液，细胞，细菌，酵母等CTAB法原理 CTAB（十六烷基三甲基溴化铵），是一种阳离子去污剂， 可溶解细胞膜，并与核酸形成复合物高盐溶液中（0.7mol/L NaCl），该复合物可溶的 有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质上清加入乙醇沉淀DNA。CTAB溶液在低于15 时会形成沉淀析出，因此在将其加入冰冷的植物材料之前必须预热，且离心时温度不要低于15。 CTAB提取缓冲液的经典配方 组份 Tris-HCl （pH8.0）EDTA （pH8.0） NaCl CTAB-巯

3、基乙醇 终浓度 100 mM 20 mM 1.4M2%(W/V)0.1%（V/V）使用前加入Tris-HCl （pH8.0）提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏；EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase活性；NaCl 提供一个高盐环境，使DNP充分溶解，存在于液相中；CTAB溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离；-巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除CTAB提取缓冲液的改进配方 组份 Tris-HCl （pH8.0）EDTA （pH8.0）NaCl CTAB PVP40-巯基乙醇 终浓度 100 mM 20 mM1.4M3%(W/V)5%(W/V)2%（V/

4、V）使用前加入PVP（聚乙烯吡咯烷酮）是酚的络合物，能与多酚形成一种不溶的络合物质，有效去除多酚，减少DNA中酚的污染；同时它也能和多糖结合，有效去除多糖。CTAB法流程图植物材料裂解液上层溶液液氮研磨抽提细胞裂解干燥溶解离心洗涤酒精沉淀DNA溶液植物基因组DNA提取试剂盒植物基因组DNA提取试剂盒新型植物基因组DNA提取试剂盒快捷型植物基因组DNA提取系统SDS法原理SDS 阴离子去垢剂 高温（5565）裂解细胞，蛋白变性，染色体离析高盐(KAc或NH4Ac) 或降低温度（冰浴） 使蛋白质及多糖杂质沉淀上清液中的DNA用酚/氯仿抽提 乙醇沉淀水相中的DNA 组份 Tris-HCl （pH8.

5、0）EDTA （pH8.0）NaCl SDS 终浓度 100mM 20 mM1.4M2%(W/V)SDS提取缓冲液的配方Tris-HCl （pH8.0）提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏；EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase活性；NaCl 提供一个高盐环境，使DNP充分溶解，存在于液相中；SDS 裂解细胞，使蛋白变性，染色体离析；血液基因组DNA提取试剂盒(0.1-1ml)血液基因组DNA提取系统(0.1-5ml)血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒细菌基因组DNA提取试剂盒酵母基因组DNA提取试剂盒病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒微量基因组DNA提取试剂盒基于SDS方法研制的

6、DNA提取试剂盒基因组DNA其它方法根据细胞裂解方式的不同有：物理方式：玻璃珠、超声波、研磨、冻融化学方式：异硫氰酸胍、碱裂解生物方式：酶法动物组织细胞裂解液上层溶液离心细胞裂解洗脱漂洗吸附柱特异性吸附DNA溶液组织匀浆SDS法流程图基因组DNA纯化的方法吸附材料纯化原理硅质材料高盐低pH值结合核酸低盐高pH值洗脱阴离子交换树脂低盐高pH值结合核酸高盐低pH值洗脱磁珠磁性微粒挂上不同基团可吸附不同的目的物，从而达到分离目的硅基质膜(离心柱型)DNA产物纯化试剂盒超薄普通大量寡核苷酸CB1CB2CB3CB25g20g40g20g100bp-20kp100bp-20kp100bp-20kp20bp

7、-10kb质粒DNA提取TIANGEN BIOTECH(BEIJING)CO., LTD. 碱裂解法 煮沸法 碱裂解法原理染色体DNA比质粒DNA分子大得多，且染色体DNA为线状分子，而质粒DNA为共价闭合环状分子；当用碱处理DNA溶液时，线状染色体DNA容易发生变性，共价闭环的质粒DNA在回到中性pH时即恢复其天然构象；变性染色体DNA片段与变性蛋白质和细胞碎片结合形成沉淀，而复性的超螺旋质粒DNA分子则以溶解状态存在液相中，从而可通过离心将两者分开。碱裂解法流程图对数期菌体溶液III中和溶液I充分重悬溶液II裂解质粒复性上层溶液离心洗脱漂洗吸附柱特异性吸附质粒DNA溶液质粒DNA提取试剂盒

8、小提小提中量高纯度小提高纯度小提中量高纯度大提无内毒素大提酵母15ml5-15ml1-5ml5-15ml100200ml100200ml15mlCB3CB4CB3CB4CB5CB240g70g40g70g最大量1000g20g去蛋白液去蛋白液去内毒素去内毒素去蛋白液细胞器DNA提取TIANGEN BIOTECH(BEIJING)CO., LTD.细胞器DNA 线粒体 叶绿体差速离心法原理是利用物质比重的不同分离混合物的一种方法。将待分离物质置于均匀介质（蔗糖）中，以一定的转速进行离心，比重大的物质优先沉降，比重小的却处于上层，从而得以分离。DNA提取及常见问题分析 DNA提取的原则 DNA提取

9、的方法 DNA提取常见问题分析材料准备细胞裂解核酸分离纯化核酸沉淀核酸溶解保存DNA提取基本步骤 基因组DNA新鲜材料，低温保存血液基因组DNA提取选择有核细胞细胞培养时间不能过长含病毒的液体材料提取前先富集 质粒DNA对数期的菌体培养时应加入筛选压力低拷贝或大质粒，应加大菌体用量菌株不要频繁转接（质粒丢失）材料准备细胞裂解核酸分离纯化核酸沉淀核酸溶解保存DNA提取基本步骤 基因组DNA材料过多影响裂解，导致DNA量少，纯度低针对不同材料，选择适当的裂解预处理方式：植物材料液氮研磨动物组织匀浆或液氮研磨培养细胞蛋白酶K细 菌溶菌酶破壁酵 母破壁酶或玻璃珠 质粒DNA菌体量适当，除净培养基变性的

10、时间不要过长（5分钟）控制复性时间，避免基因组DNA的污染G菌、酵母细胞酶或机械处理材料准备细胞裂解核酸分离纯化核酸沉淀核酸溶解保存DNA提取基本步骤采用吸附材料吸附分离DNA，应提供相应的缓冲体系采用有机溶剂（酚/氯仿）抽提时应充分而轻柔的混匀离心分离两相时，应保证一定的转速和时间针对不同材料的特点，在提取过程中辅以相应的去杂质的方法材料准备细胞裂解核酸分离纯化核酸沉淀核酸溶解保存DNA提取基本步骤蛋白质的去除：酚/氯仿抽提使用变性剂（SDS、异硫氰酸胍等）蛋白酶处理材料准备细胞裂解核酸分离纯化核酸沉淀核酸溶解保存DNA提取基本步骤多糖的去除：多糖水解酶在提取缓冲液中加1/2体积氯苯，氯苯可

11、以与多糖的羟基作用，从而去除多糖 。用PEG8000代替乙醇沉淀DNA：在500L DNA液中加入200l 20% PEG8000 (含1.2 M NaCl) ，冰浴20min。材料准备细胞裂解核酸分离纯化核酸沉淀核酸溶解保存DNA提取基本步骤多酚的去除：加入还原剂：-巯基乙醇、抗坏血酸、半胱氨酸、二硫苏糖醇等加入易与酚类结合的试剂：如PVP、PEG，可防止酚类与DNA的结合盐离子的去除：70的乙醇洗涤材料准备细胞裂解核酸分离纯化核酸沉淀核酸溶解保存DNA提取基本步骤预冷的乙醇或异丙醇更充分沉淀加入1/10体积的NaAc（pH5.2，3M）更充分沉淀晾干DNA，让乙醇充分挥发材料准备细胞裂解核

12、酸分离纯化核酸沉淀核酸溶解保存 若长期储存建议使用TE缓冲液溶解 pH值为8.0，可防止DNA发生酸解DNA提取基本步骤问题一：DNA降解材料不新鲜、反复冻融或细胞衰老提取操作过于剧烈，DNA被打断外源核酸酶污染低温保存，避免反复冻融液氮研磨或匀浆组织，应在解冻前加入裂解缓冲液增加裂解液中螯合剂的含量细胞裂解后操作应尽量轻柔试剂用无菌水配制，耗材经高温灭菌DNA分装保存于缓冲液，避免反复冻融问题二： DNA样品不纯 DNA中含有蛋白、多糖、多酚类杂质DNA在溶解前，有酒精残留，酒精抑制后续酶解反应DNA中残留有金属离子重新纯化DNA，去除蛋白、多糖、多酚等杂质（具体方法见前）重新沉淀DNA，让

13、酒精充分挥发增加70乙醇洗涤的次数（2-3次）实验材料不佳或量少破壁或裂解不充分沉淀不完全洗涤时DNA丢失尽量选用新鲜（幼嫩）的材料动植物要匀浆研磨充分；G菌、酵母裂解前先用生物酶或机械方式破壁高温裂解时，时间适当延长（对于动物细胞、细菌可增加PK的用量）低温沉淀，延长沉淀时间加辅助物，促进沉淀洗涤时，最好用枪头将洗涤液吸出，勿倾倒问题三：DNA提取量少RNA提取及常见问题分析TIANGEN BIOTECH(BEIJING)CO., LTD. RNA提取相关知识 RNA提取方法及注意事项 RNA提取常见问题及其分析 含10g RNA的材料量 107 个细胞 30mg动物组织 30-100mg植

14、物组织rRNA 占8085mRNA占1-5%AAAAAA细胞中RNA的种类和含量AAAAAAtRNAmRNArRNARNAasemRNA的应用 RT-PCR, Northern杂交，cDNA文库构建 mRNA末端快速扩增(RACE)，差异表达(DDRT-PCR)，引物延伸反应，体外转录RNA标记，RNA酶保护试验，RNA微注射(RNA Microinjection) RNA的不稳定性 内因：核糖残基的2和3位置带有羟基，易被水解 外因：内源、外源RNA酶含量丰富，加热后仍能 够正确折叠恢复活性，不易失活 常用的RNA酶抑制剂 焦碳酸二乙酯（DEPC）与RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环结合使蛋白

15、质变性，强烈但不彻底的RNA酶抑制剂 异硫氰酸胍目前是最有效的RNA酶抑制剂，裂解组织的同时也使RNA酶失活。 RNasin 从大鼠肝或人胎盘中提取得来的酸性糖蛋白。可以和多种RNA酶结合，使其失活 氧钒核糖核苷复合物由氧化钒离子和核苷形成的复合物，它和RNA酶结合形成过渡态类物质，几乎能完全抑制RNA酶的活性 SDS、尿素、硅藻土等常用的RNA酶抑制剂 RNAsafe RNasinRNA酶抑制剂 RNA提取相关知识 RNA提取方法及注意事项RNA提取常见问题及其分析异硫氰酸胍/苯酚法细胞在变性剂异硫氰酸胍的作用下被裂解，同时核蛋白体上的蛋白变性，核酸释放 释放出来的DNA和RNA由于在特定p

16、H下溶解度的不同而分别位于整个体系中的中间相和水相，从而得以分离RNA提取流程示意图研磨或匀浆细胞裂解水相有机相氯仿加入裂解液 (TRNzol)离心动植物材料动植物材料研磨或匀浆细胞裂解基因组DNA水相有机相RNA氯仿纯化pH5.7离心加入裂解液(TRNzol)RNA提取流程示意图等体积异丙醇沉淀70乙醇洗涤沉淀晾干溶解RNA吸附柱去蛋白液漂洗洗脱水相RNA传统方法：有机溶剂抽提，得率高柱纯化法：纯度高，无有机溶剂RNA提取流程示意图提取RNA的注意事项 经常更换新手套。皮肤和实验室用品上可能有 RNase，会导致RNase污染 塑料器皿可用0.1%DEPC水浸泡4-10小时，再灭菌 玻璃器皿

17、可在180-240烘烤4小时 塑料制品和枪头避免交叉污染可选择的RNA提取产品TRNzolRNAsimpleRNAplantRNAprep普遍适用动物组织富含多糖和酚类的植物叶片动物/细菌、植物、血液、细胞、微量50-100mg/1ml50-100mg/离心柱50-100mg/1ml RNA提取相关知识 RNA提取方法及注意事项 RNA提取常见问题及其分析材料准备TRNzol裂解细胞加入氯仿抽提RNA沉淀柱纯化 RNA溶解 保存植物组织选取杂质少生长较快的幼嫩部位培养细胞除尽培养液消化系统的组织选取杂质少的部位细菌和酵母需要破壁处理样品切成小块投入液氮或专门的RNA样品储存液中保存液氮研磨时不

18、要使液氮挥发净RNA提取基本步骤材料准备TRNzol裂解细胞 加入氯仿抽提RNA沉淀柱纯化RNA溶解保存异硫氰酸胍、苯酚 (TRNzol)裂解细胞灭活RNaseTRNzol要与细胞组织充分接触裂解尽量充分RNA提取基本步骤材料准备TRNzol裂解细胞 加入氯仿抽提RNA沉淀柱纯化RNA溶解保存氯仿抽提时充分混匀离心分离两相，保证一定的转速和时间，使蛋白质、多糖和DNA分布到有机相和中间层，RNA留在水相中注意避免吸入中间层不慎吸入再次用有机溶剂抽提RNA提取基本步骤材料准备TRNzol裂解细胞 加入氯仿抽提RNA沉淀柱纯化RNA溶解保存异丙醇低温沉淀RNA高盐低pH值，核酸与硅胶膜结合70乙醇洗涤，晾干用经DEPC处理过的水或专门的试剂来洗脱或溶解RNA70 分装保存或加入RNase抑制剂(RNAsafe)RNA提取基本步骤RNA提取常见问题一：样品不纯 蛋白多糖多酚DNA离子保证彻底的裂解和一定转数一定时间的离心增加有机溶剂抽提的次数，用吸附柱纯化减少处理样品的量加入不含RNase的DNase处理；再次纯化RNA提取常见问题二：得率低 减少或增加样品使用量加入RNasefree,放置几分钟再离心漂洗后再次离心 样品太多或太少 RNA在柱子上未洗出 洗出液中有酒精RNA