一株高效烟碱降解内生菌的分离及降解特征研究

1、 一株高效烟碱降解内生菌的分离及降解特征研究 林智慧 邓新发 王雪仁 苏丹 封磊 宋萍摘 要：为了解烟草内生菌的烟碱降解机制，以一株具有高效烟碱降解功能的内生菌G16为对象，通过降解培养及代谢产物分析，对其烟碱降解特征进行研究。结果表明，该菌株经鉴定为Rhizobium sp.G16，在烟碱培养基中的生长符合Slogistic模型，烟碱对G16菌株的最大生长抑制浓度为4000 mg/L;G16菌株的烟碱降解受到pH、接种量及烟碱浓度的影响，其降解过程可采用一级动力学模型进行描述;对G16菌株降解烟碱的中间代谢产物进行分析，发现主要为尼古丁提林、3-（3， 4-dihydro-2H-pyrrol

2、-5-yl）pyridine、脱甲基尼古丁、2，3-联吡啶、可铁宁等物质。Key：烟碱;内生菌;降解特征;动力学;中间产物Abstract： In order to understand the nicotine-degrading mechanisms of tobacco endophytes， an endophytic bacterial strain G16 with a high efficiency nicotine-degrading capability was chosen， and its nicotinedegrading characteristics were st

3、udied through the methods of nicotine degradation culture and metabolite analysis. The results showed that the strain G16 was identified as Rhizobium sp.G16 and its growth in nicotine medium could be fitted well by the Slogistic model. The growth inhibition concentration of nicotine for strain G16 w

4、as 4000 mg/L. The nicotine degradation capability of strain G16 was affected by pH value， inoculation amount of bacterium， and nicotine concentration of broth. Moreover， the results of metabolite analysis by GC-MS showed that the intermediate products of G16 nicotine degradation included nicotyrine，

5、 3-（3，4-dihydro-2H-pyrrol-5-yl） pyridine， nornicotine， cotinine， and so on.Keywords： nicotine; entophyte; degradation characteristics; dynamics; intermediate product烟碱又称尼古丁，是烟草生物碱的主要成分，也是衡量烟草品质的重要指标1。我国是烟草生产大国，所产烟叶在外观质量上已接近或达到先进产烟国的标准，但其内在品质还存在一定的差距，其中一个重要的原因就是上部烟叶中烟碱含量普遍过高，影响了烟叶质量和工业可用性2。因此如何降低上部烟叶

6、中的烟碱含量，已成为烟草行业急需解决的问题。截止目前，国内外相关学者已在品种选育、农业种植、物化处理、生物降解等多个领域就如何降低烟叶中烟碱含量进行了大量研究3-6，虽然取得了一定的进展，但种植烟叶质量受困于烟碱含量这一问题仍然没有得到有效解决。近年来，随着研究的不断深入，一些具有烟碱降解功能的烟草内生菌被陆续发现，并引起了研究者的广泛關注。如李天丽7从陈化烟叶中分离得到具有降解烟碱活性的混合菌群，并通过液体发酵培养对该混合菌群的烟碱降解行为进行了研究;赵丽萍等8从62个烟叶样品中筛选出一株烟碱降解内生细菌，该菌在烟碱质量分数为1的培养基中培养54 h后，其最高降解率为98.76%;米其利9则

7、从晒烟调制期烟叶中分离出一株Pseudomonas sp.L16，将该菌株的发酵液喷洒在烟叶表面不但能有效降低烟叶中烟碱含量，还会使烟叶的内在化学成分更加协调。然而，目前有关内生菌降解烟碱方面的研究尚处于初始阶段，所涉及内容也多集中在分离鉴定及田间施用方面，关于烟草内生菌对烟碱降解机制方面的研究，则罕见报道。而了解这些内生菌的烟碱降解机制，对进一步探究该类菌株在烟草体内烟碱生物合成过程中的功能作用具有重要意义。本研究以一株从福建三明烟区筛选的高效烟碱降解内生菌为对象，对其生长及烟碱降解特征进行研究，其研究成果对于揭示烟草内生菌的烟碱降解机制，促进植物内生菌在烟草领域的实际应用具有一定的参考价值

8、。1 材料与方法1.1 材料供试烟草植株：供试烟草植株于2019年5月采集于福建省烟科所三明市分所沙阳田间试验场，品种为云烟87。主要试剂：烟碱（分析纯，质量分数97%），购自罗恩公司;烟碱标准品（色谱级，HPLC98%），购自麦卡希;甲醇（色谱级，质量分数99.99%），购自阿拉丁公司;磷酸氢二钠，磷酸二氢钾纯度均为色谱纯，其他试剂均为AR级试剂。烟碱培养基：K2HPO43H2O 13.3 g，MgSO47H2O 0.2 g，微量元素溶液（MnSO47H2O 0.4 g，CaCl22H2O 0.2 g，FeSO47H2O 0.2 g使用0.1 mol/L HCl定容至100 mL）0.5 m

9、L，加水定容至1000 mL，pH为7.0，于121 灭菌20 min10。烟碱灭菌后经0.22 m滤膜过滤，备用。上述烟碱培养基中加入18 g琼脂即为烟碱固体培养基。1.2 降烟碱内生菌的分离采用组织分离和平板涂布法分离内生菌11。选取健康的烟草植株，对其根、茎、叶进行清洗、消毒。以最后一次清洗的无菌水为空白对照，检验其表面消毒效果。将表面消毒的植物组织研磨成匀浆，稀释涂布在烟碱固体培养基上，30 恒温培养箱培养3 d。挑取不同形态的单菌落，经多次划线培养得到纯菌。1.3 菌种鉴定1.3.1 菌株形态特征 将筛选得到的内生菌挑取至烟碱固体培养基中培养3 d，观察平板中菌落的生长情况，并在扫描

10、电子显微镜下（Phenom ProXSEM）观察其形态特征。1.3.2 16S rDNA序列测定 内生菌的DNA纯化与16S rDNA测序工作由上海美吉生物公司完成。16S rDNA扩增的通用引物为27F：5-AGAGTTTGATC CTGGCTCAG-3和1492R：5-GGTTACCTTGTTA CGACTT-3。PCR反应程序为：95 预变性5 min，95 30 s，56 30 s，72 90 s，25次循环，72 延伸10 min，40 保存。测序结果通过NCBI上的Blast程序进行同源性比对，并利用MEGA6软件的Neighbor-Joining构建系统进化树。1.4 菌株生长动

11、力学研究将内生菌种子液按1%的接种量接种至50 mL的烟碱培养基中（pH=7.0，烟碱浓度为500 mg/L），于150 r/min回旋振荡、30 下恒温培养30 h，每3 h对培养进行取样，测定其在600 nm波长下的OD值，利用Slogistic模型对内生菌进行生长曲线动力学拟合12，并计算相关的拟合模型参数。式中：t为时间;和分别表示在时间t时和初始时间的菌株数量;为最大菌数与初始菌数的差值;为菌株达到最大生长速率的时间;为在时间点的最大生长速率;为菌株最大比生长速率;为菌株生长的延滞期。1.5 菌株生长的抑制浓度测定分别在烟碱浓度为100、500、1500、2000、3000和5000

12、 mg/L的液体培养基中，接种1%的内生菌种子液，150 r/min、30 下恒温培养至稳定期后，测定其在600 nm下的吸光值（OD），每个处理3次重复。1.6 菌株降解烟碱特性研究1.6.1 烟碱浓度测定 采用高效液相色谱（Thtermo Fisher U3000）测定烟碱浓度13。色谱柱为Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18（4.6250 mm，5 m），紫外检测器，检测波长为254 nm。流动相为甲醇与0.02 mol/L磷酸盐缓冲溶液（pH=6.5）混合溶液，体积比为60：40，流速0.6 mL/min，进样量10 L，柱温35 。1.6.2 pH、接种量和

13、烟碱浓度对菌株降解烟碱能力的单因素影响 将培养24 h的内生菌种子液接种到烟碱培养基中，依次测定pH值为5、6、7、8、9，接种量为1%、2%、5%，烟碱浓度为500、1500、2000、3000 mg/L时菌株的生长及烟碱降解情况，每次都将上一优化结果用于下一因素的优化。1.6.3 降解动力学 将内生菌种子液按1%的接种量接种至50 mL的烟碱培养基中，在pH=7.0，烟碱初始浓度为500、1500、2000、3000 mg/L条件下培养48 h，每6 h进行取样，测定其在600 nm波长下的OD值，采用一级反应动力学公式（4）对烟碱降解情况进行拟合。式中，为烟碱的初始浓度（mg/L）;为t

14、时刻體系中烟碱的浓度（mg/L）;k为烟碱降解速率常数（h-1）;t为降解时间（h）。1.7 降解产物分析将内生菌种子液按1%的接种量接种至50 mL的烟碱培养基中（pH=7.0，烟碱浓度为500 mg/L），于150 r/min回旋振荡、30 下恒温培养24 h，每6 h进行取样，测定其在600 nm波长下的OD值，样品于4 、12000 r/min，离心30 min后获得上清液。上清液经0.22 m滤膜过滤后以高纯氮气吹缩至1 mL，用于气质联用仪（岛津GCMS-TQ8040）检测14。检测条件为：进样口温度为250 ，分流模式，SH-Rxi-5Sil MS色谱柱。程序升温：60 保持2

15、min，以10 /min速率升温至280 ，保持10 min。质谱条件为：离子源温度250 ，扫描范围28500 m/z，载气氦气，流速1.0 mL/min。采集完的数据，经过GCMS Postrun Analysis定性处理，检索谱库为NIST4谱库。2 结 果2.1 降烟碱功能内生菌的筛选及鉴定利用烟碱培养基，从烟草根部分离筛选出1株具有高效降解烟碱功能的内生细菌G16（图1）。该菌株为半透明的淡黄色湿润菌体，菌落呈现圆凸型，易于挑起，通过扫描电子显微镜观察菌体形态特征，发现菌株G16呈现直杆状，菌体大小约为0.61.0 m。通过16S rDNA序列测定，并经Blast程序比对，发现菌株G

16、16与热带根瘤菌Rhizobium tropici CIAT 899 （NR-102511.1）的相似度为99%，表明菌株G16为根瘤菌属，故命名为根瘤菌G16（Rhizobium sp.G16），并且在构建的系统发育树中，菌株G16也与热带根瘤菌Rhizobium tropic处于同一分支（图2）。同时，菌株G16的16S rDNA测序结果已上传到GenBank数据库，注册登录号为MN712240。2.2 菌株生长动力学研究采用Slogistic模型对菌株G16在烟碱培养基中的生长过程进行拟合（图3），相关的拟合参数如表1所示。由表1的数据可知，Slogistic模型的拟合程度较高，R2为0

17、.989，可以较好地描述菌株G16的生长情况。另外，通过该模型预测可知，菌株G16在烟碱培养基中经过16.509 h可达到其最大生长速率，最高菌体生长数量的OD600值为0.173，最大菌体比生长率约为0.016，生长延迟期约为11.059 h。2.3 菌株G16的生长抑制浓度由图4可知，不同浓度的烟碱会对菌株G16生长产生不同程度的影响，其菌体数量随着烟碱浓度的增大呈现出先增加后减少的趋势。当烟碱浓度介于15003000 mg/L之间时，G16生长良好，并且当烟碱浓度为1500 mg/L时，菌株G16的细胞生长量最大，而当烟碱浓度增至4000 mg/L时，则该菌株的生长迅速下降，表明烟碱对菌

18、株G16的最小生长抑制浓度为4000 mg/L。2.4 菌株G16的烟碱降解特性2.4.1 pH对菌株G16降解烟碱的影响 不同pH对菌株G16烟碱降解能力的影响如图5所示。从图中可知，在pH值为5.08.0范围内，菌株G16均能取得较高的烟碱降解率，并且当pH值为7.0时，烟碱的降解率最高，为93%。然而，当培养基中pH值超过8.0时，该菌株的烟碱降解能力则明显受到抑制。2.4.2 接种量对菌株G16降解烟碱的影响 菌株G16接种量对其烟碱降解能力的影响如图6所示。当接种量为1%、2%、5%、10%时，菌株G16达到其最高烟碱降解率的时间分别为24、24、15和12 h，说明菌体接种量的增加

19、可以显著提升菌株G16对烟碱的降解速率。然而，经过24 h的培养，对比不同接种量条件下的煙碱最终降解数量，发现并无明显差异，均可达到约90%左右的降解率，表明菌体接种量对最终烟碱降解率影响不大。2.4.3 烟碱浓度对菌株G16降解烟碱的影响 由于不同菌株对高毒性烟碱耐受程度的不同，其降解能力受烟碱浓度影响的程度也存在着一定的差异。从图7可以看出，当烟碱浓度为500 mg/L时，菌株G16降解速率最快，在培养24 h后基本降解完全;当烟碱浓度为1500和2000 mg/L，其降解速率较慢，在培养48 h后其降解率分别为92%、89%。当烟碱浓度为3000 mg/L时，则在48 h内无法完全降解，

20、降解率仅为32%。2.4.4 降解动力学分析 采用一级动力学模型对菌株G16的烟碱降解行为进行拟合，相关拟合参数如表2所示。从表中可知，当菌体接种量一定时，菌株G16的烟碱降解速率常数随着浓度的增大而减小。其相关系数R2为0.880.95，说明该模型可以较好的反映菌株G16的烟碱降解情况。2.5 降解产物分析采用气质联用仪（GC-MS）对菌株G16在降解烟碱过程中的中间代谢产物进行分析检测，结果如图8所示。从检测结果可以发现，其成分主要包括烟碱（Nicotine，RT=12.303 min）、脱甲基尼古丁（RT=13.326 min）、3-（3，4-dihydro-2H-pyrrol-5-yl

21、） pyridine（RT=13.396 min）、尼古丁提林（RT=14.096 min）、新烟碱（RT=14.286 min）、去氢新烟碱（RT=14.666 min）、2，3-联吡啶（RT=14.884 min）、2，5，6-trimethyl-1H-benzimidazole（RT=15.356 min）、可铁宁（RT=16.97 min）和2-cyclohexylidene- cyclohexanone（RT=17.855 min）等物质。3 讨 论植物内生菌是指那些在其生活史中的某一段或全部时期生活在植物组织内，对植物组织没有引起明显外观特征变化的微生物15。内生菌长期生活在植物体

22、内环境中并与宿主协同进化，其对宿主植物的生长和生理生化均会产生重要影响。近年来，伴随着微生物降解烟碱研究的兴起，一些具有烟碱降解功能的烟草内生菌被不断分离出来，而了解这些内生菌的烟碱降解特征及作用机制，有助于揭示该类微生物在宿主烟碱合成过程中所扮演的功能角色。本研究所筛选的烟草内生菌Rhizobium sp. G16对烟碱的降解率最高可达93%，但其生长情况却与培养基中的烟碱浓度密切相关，浓度过高或过低均不利于该菌株的生长。而之所以出现这种情况，是由于烟碱作为培养基中唯一的碳源与氮源，当其处于低浓度时，其供给量无法满足G16的生长，而随着烟碱浓度的升高，G16获取了生长所需的营养，菌体数量明显

23、增加，但当烟碱的浓度超出了G16生长所需，过量的烟碱又会对菌体的生长产生抑制效应。另外，不同烟碱降解菌受pH值的影响也不尽相同，如万虎等16从烟草废弃物中筛选出一株恶臭假单胞菌P. putida，但该菌株只有在pH为6.57.5时才具有较高的烟碱降解活性。而本研究筛选的内生菌G16，在pH值为5.08.0范围内，烟碱降解率均可达到90%上下，拥有更好的酸碱适应能力。目前，尽管已报道了多株微生物对烟碱的降解途径，然而由于微生物种类众多，有关根瘤菌属（Rhizobium sp.）代谢烟碱的途径，至今尚未见报道。在Rhizobium sp. G16的烟碱降解中间产物中，脱甲基尼古丁（Nornicot

24、ine，产物I）、尼古丁提林（Nicotyrine，产物II）、可铁宁（Cotinine，产物III）为烟碱常见的代谢产物17-20，与Pseudomonas sp.HF-1代谢烟碱的产物有一定的相似性，而新烟碱和去氢新烟碱两种化合物也是在烟碱降解过程中常见的物质，并且为含量较高的次要生物碱成分。至于3-（3，4-dihydro-2H-pyrrol-5-yl）pyridine，WANG等21在研究Pseudomonas sp. CS3的烟碱代谢过程时，也曾检测到该化合物，并推测其是由烟碱去甲基化而形成的;而2，3-联吡啶也曾在Pseudomonas sp. Nic2222和Sphingomon

25、as sp. TY14的烟碱代谢过程中被检测出来过，但该物质在微生物烟碱代谢中究竟是如何生成的，至今还未见相关的报道。综上所述，由于Rhizobium sp. G16的烟碱降解中间产物与Pseudomonas sp.菌属的烟碱降解产物具有较多的重合性，推测二者可能具有类似的烟碱降解途径。4 结 论本研究筛选的高效烟碱降解内生菌经鉴定为Rhizobium sp. G16，其生长符合Slogistic模型，降解活性最高抑制浓度为4000 mg/L。菌株G16在pH为5.08.0范围内，降解率均为90%以上，具有较好的稳定性和适应范围。G16对烟碱的降解速率随着接种量的增加而增加，但对24 h后烟碱

26、的最终降解程度并无显著差异。菌株G16为新发现的降烟碱微生物，通过中间产物分析，推测其与Pseudomonas sp.菌属具有类似的烟碱降解途径。下一步将继续对不同阶段烟碱降解产物进行检测及深入分析，以揭示菌株G16的烟碱降解机制。Reference1尹鹏嘉，任民，孙鑫，等. 烤烟主要农艺性状变异特征以及与烟碱含量的相关分析J. 中国烟草科学，2018，39（1）：10-16.YIN P J， REN M， SUN X， et al. Variation of main agronomic traits and correlation analysis of nicotine content

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