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1、 丁酸钠和5氮杂胞苷对大麦、水稻、玉米、小麦种子萌发及芽苗期生长的影响 侯泽豪+杨飞+商水根+方汉顺+张文英+徐延浩Summary: 比较1、10、20 mmol/L的丁酸钠溶液和1 mol/L、50 mol/L、100 mol/L、1 mmol/L、10 mmol/L的5-氮杂胞苷(5-azacytidine,简称5-AC)溶液对大麦、水稻、玉米和小麦等4种作物种子萌发和幼苗生长发育的影响。结果表明,丁酸钠、5-AC处理均可抑制种子萌发、植株株高及根长的生长。受害指数分析结果表明,4种作物对5-AC处理较丁酸钠处理敏感。从顶端生長来看,玉米对丁酸钠处理较敏感,大麦对5-AC处理最敏感。丁酸钠

2、对小麦根系数目增加的促进作用最强;低浓度5-AC对玉米根系数目增加的促进作用最强;但高浓度5-AC抑制根系数目的增加。受害指数关联分析结果表明,丁酸钠、5-AC处理对植物顶端生长点与侧向器官发生组织具有不同的影响,说明丁酸钠、5-AC对不同的器官具有不同的表观遗传调控效果。Key: 禾本科作物;丁酸钠;5-氮杂胞苷;种子萌发;幼苗生长;受害指数: S351.5+3 文献标志码: A:1002-1302(2017)22-0073-04表观遗传是一种不涉及DNA序列改变但可以通过有丝分裂和(或)减数分裂实现代间传递的变异,这些变异主要包括组蛋白共价修饰和DNA甲基化等。表观遗传机制在植物发育、非生

3、物逆境抗性等方面起着关键作用1,对油菜2、大麦3和玉米4种子萌发及幼苗建立阶段的研究表明,种子萌发伴随着DNA去甲基化及组蛋白乙酰基化水平的改变。此外,外源激素处理通过改变种子的表观遗传修饰模式而影响种子的萌发5。由此可见,表观遗传修饰是控制种子萌发、生长的重要机制。5-氮杂胞苷(5-azacytidine,简称5-AC)和丁酸钠(sodium butyrate)是2种重要的表观遗传调控试剂。5-氮杂胞苷能降低基因组DNA甲基化水平,丁酸钠可抑制组蛋白去乙酰化酶的活性,提高组蛋白乙酰化水平。5-AC可调控植物的生长发育、促进植株开花、增强作物的耐湿性6和耐盐性7。5-AC对小麦8、白菜9、萝卜

4、10和菠菜11等植物种子的处理结果表明,5-AC可引起基因组DNA甲基化水平的下降,且其表型效应与处理浓度相关8。丁酸钠处理能促进水稻花培绿苗的形成12,但不能显著提高大麦苗期的耐湿性6。与5-AC相比,关于丁酸钠对种子萌发和幼苗发育影响还知之甚少,缺乏丁酸钠与5-AC对作物种子萌发及幼苗生长效应的系统对比研究。本研究使用不同浓度的丁酸钠溶液和5-AC溶液对大麦、水稻、玉米及小麦进行处理,统计种子萌发率、幼苗株高、根系发育情况以及植株的干质量等指标,系统比较这4种禾本科作物对丁酸钠和5-AC等2种表观遗传试剂处理的敏感性差异,为研究DNA去甲基化、组蛋白乙酰化水平升高对种子萌发和幼苗发育的影响

5、提供依据,为从表观遗传学角度探索种子萌发和幼苗发育积累更多的资料。1 材料与方法1.1 试验材料供试材料为大麦苏啤3号(Hordeum vulgare L. cv. Supi3)、水稻丰美占(Oryza sativa L. cv. Fengmeizhan)、玉米郑单958(Zea mays L. cv. Zhengdan958)、小麦湘麦10号(Triticum aestivum L. cv. Xiangmai10)。供试大麦、水稻、小麦材料由笔者所在单位保存,玉米购于种子市场。1.2 试验方法选取饱满的种子,用75%的乙醇消毒30 s,清水润洗后置于铺有2层滤纸的发芽盒中,分别加入不同浓度的

6、丁酸钠溶液和5-AC溶液,并置于人工气候箱(上海佳语JYC-412)中暗培养24 h之后进行周期性光照培养,光照度为 10 000 lx,光暗周期为12 h12 h。大麦和小麦的发芽培养温度为25 /20 (昼/夜),玉米和水稻为35 /30 (昼/夜)。培养期间每天08:00补充1次相同浓度的溶液。试验包括对照组(清水发芽培养)、5-氮杂胞苷组和丁酸钠组。5-氮杂胞苷(A2385)和丁酸钠(V900464)购自Sigma公司。5-氮杂胞苷(5-AC)组设置5个处理浓度,分别为 1 mol/L、50 mol/L、100 mol/L、1 mmol/L、10 mmol/L。丁酸钠处理组设置3个处理

7、浓度,分别为1、10、20 mmol/L。每个处理重复3次,玉米每次50粒,其他材料100粒。1.3 测定指标及分析方法各试验材料培养7 d后,分别测定每个处理的发芽率(发 芽率=7 d 内总发芽种子数/供试种子数100%)、株高、种子根长、根系数量以及植株干质量。鲜质量的测定选取玉米10株,其他材料50株。测定其全株(包含已萌发的种子)鲜质量后,105 杀青15 min,60 烘至恒质量,测定植株干质量。表观遗传试剂处理对各作物、各类组织的伤害程度用表观遗传受害指数评价,受害指数=(对照组织数据-处理组织数据)/对照组织数据100%。用苗高受害指数评价茎尖生长点的受害程度,用根长受害指数评价

8、根尖生长点的受害程度,用初生根系数量评价根部的侧生器官形成能力。用加权平均受害指数评价每种材料对丁酸钠和5-AC的敏感性,加权平均受害指数=丁酸钠溶液/5-AC溶液浓度对应浓度受害指数之和/(丁酸钠溶液/5-AC溶液浓度)浓度之和。用SPSS 19.0对试验数据进行统计、方差分析和多重比较(P0.05)。2 结果与分析2.1 丁酸钠和5-AC对4种禾本科作物种子萌发的影响由图1可知,对照条件下,大麦、水稻、玉米和小麦发芽率分别为96.67%、95.67%、95.67%和96.67%。1 mmol/L的丁酸钠溶液对这4种作物种子的发芽率没有影响;与对照相比,10 mmol/L丁酸钠溶液处理后4种

9、作物的发芽率均降低,分别为90.00%、91.00%、86.67%和84.33%;20 mmol/L 丁酸钠处理大麦、水稻、玉米和小麦的发芽率分别为84.33%、87.67%、80.00%和80.00%。结果表明,丁酸钠浓度越高,对种子萌发的抑制作用越强。 由图2可知,1、50 mol/L的5-AC溶液处理对4种作物的发芽率影响较小;100 mol/L的5-AC溶液处理,水稻的发芽率降低5.67百分点(P2.2 丁酸钠和5-AC对4种作物株高的影响由图3可知,与对照相比,1 mmol/L丁酸钠溶液对水稻、玉米和小麦株高的生长无显著影响,对大麦株高表现出促进作用, 株高显著增加 3.24%。 1

10、0 mmol/L 丁酸钠溶液处理大麦、水稻、玉米和小麦株高的受害指数分别为19.08%、1756%、58.70%和33.43%;20 mmol/L丁酸钠溶液处理4种作物株高的受害指数分别为39.83%、19.77%、74.95%和 50.93%。由图4可知,与对照相比,1 mol/L的5-AC处理对4种作物的株高没有显著影响;50 mol/L的5-AC处理对大麦、玉米和小麦的株高没有显著影响,但水稻株高显著提高10.14%。100 mol/L和1、10 mmol/L的5-AC处理,大麦株高受害指数分别为2.20%、9.71%和100.00%,玉米株高受害指数分别为28.38%、57.54%和7

11、6.42%。小麦仅在 10 mmol/L 的5-AC处理下株高显著受害,受害指数为 28.97%。水稻株高在100 mol/L和1 mmol/L的5-AC处理下与对照差异不显著,较50 mol/L的5-AC处理下降;在10 mmol/L的5-AC处理下的株高较对照显著下降,受害指数为61.64%。2.3 丁酸钠和5-AC对4种禾本科作物根系发育的影响由表1可知,大麦在1、10 、20 mmol/L丁酸钠处理下,根长受害指数为9.81%、61.43%、72.15%。玉米在1、10、20 mmol/L 丁酸钠溶液处理下根长的受害指数分别为 14.22%、42.71%、70.09%。小麦在10、20

12、 mmol/L的丁酸钠溶液处理下,根长受害指数分别为29.34%、63.17%。与对照相比,1 mmol/L 丁酸钠溶液显著促进水稻根长的生长,根长增加19.69%,10 mmol/L丁酸钠溶液对水稻根长没有显著影响,而在20 mmol/L丁酸钠溶液处理下根长的受害指数为 18.38%。由表1还可知,与对照相比,1 mmol/L丁酸钠溶液处理对大麦、水稻、玉米和小麦的初生根系数量没有显著影响;10 mmol/L 的丁酸钠溶液处理大麦、水稻、小麦的根系数量分别增加25.81%、16.95%和22.29%,但对玉米的根系数量没有显著影响;20 mmol/L 的丁酸钠溶液处理大麦、水稻、玉米、小麦的

13、根系数量分别增加14.52%、13.56%、9.05%和34.10%。由表2可知,大麦和玉米根长受害程度随着5-AC处理浓度增加而增加,浓度从1 mol/L 到10 mmol/L,大麦根长受害指数分别为11.14%、38.82%、62.26%、73.90%和9169%,玉米根长受害指数分别为25.29%、31.69%、6262%、81.36%和90.30%。小麦根长在 1 mmol/L 的5-AC溶液处理时出现显著受害情况,受害指数为25.91%;10 mmol/L 的5-AC溶液处理与1 mmol/L的 5-AC溶液处理小麦根长受害程度无显著差异。与对照相比,1 mol/L 至1 mmol/

14、L的5-AC处理对水稻根长生长没有显著影响,10 mmol/L 的5-AC溶液处理时,根长害指数为 85.34%。由表2还可知,当5-AC浓度由50 mol/L上升至 1 mmol/L 时,大麦的根系数量随着5-AC浓度增加而增加,在1 mmol/L时根系数量达到最大,较对照增加25.97%;10 mmol/L 的5-AC处理时,大麦根系数量较其他处理显著减少,受害指数为 47.58%。在1 mmol/L的5-AC处理时小麦的根系数量与对照相比显著增加16.76%;在10 mmol/L的5-AC处理时,根部的侧生器官形成能力受到抑制,受害指數为 12.76%。与对照相比,1 mol/L至1 m

15、mol/L的5-AC处理对水稻根系数量的影响不显著,但在10 mmol/L的 5-AC处理下表现出显著受害现象,受害指数76.27%。玉米的根系数量在5-AC各浓度处理下均无显著变化。2.4 丁酸钠和5-AC对4种禾本科芽苗期生物量的影响由表3可知,丁酸钠对4种作物芽苗期的生长整体表现出抑制作用,且浓度越高抑制越强烈。与对照相比,1 mmol/L的丁酸钠溶液对水稻干质量没有显著影响。10 mmol/L的丁酸处理大麦、水稻、玉米和小麦干质量的受害指数分别为2150%、12.28%、12.03%和39.11%。20 mmol/L的丁酸钠处理4种作物干质量的受害指数分别为31.43%、14.75%、

16、18.20%和37.83%。与对照相比,丁酸钠处理对4种作物幼苗的含水量无显著影响。由表3还可知,大麦干质量的积累在5-AC处理下受到抑制,50、100 mol/L和1、10 mmol/L处理下的受害指数分别为9.49%、8.72%、22.82%、90.04%。水稻的干质量仅受 10 mmol/L 的5-AC显著影响,受害指数为 24.69%。与对照相比,100 mol/L和1、10 mmol/L的5-AC处理下,玉米干质量显著下降,受害指数分别为15.11%、19.22% 和2267%。与对照相比,小麦的干质量在100 mol/L、1 mmol/L 和10 mmol/L的5-AC处理下显著下

17、降,受害指数分别为 9.46%、13.50%和55.47%。与对照相比,5-氮杂胞苷处理也未对作物幼苗的含水量产生显著影响。 2.5 4种作物对丁酸钠和5-AC处理的敏感性与器官反应加权平均受害指数分析结果(表4)表明,5-AC引起的株高、根长、根系数量受害程度要明显高于丁酸钠处理。从株高和根长的加权平均受害指数来看,玉米对丁酸钠处理最敏感,其次是小麦、大麦,水稻对丁酸钠处理的耐受最强;大麦对5-AC处理最敏感,其次是玉米、水稻,小麦对5-AC处理的耐受最强。从根系数量的加权平均受害指数来看,丁酸钠对小麦的侧向器官发生的促进作用最强,其次是大麦和水稻,并且影响程度相当; 5-AC对玉米、小麦、

18、大麦和水稻的影响主要表现为抑制侧向器官的发生。对单苗干质量受害指数与株高、根长和根系数量的受害程度的关联分析结果(表5)表明,丁酸钠处理单苗干质量受害指数与株高、根长呈正相关关系,而与根系数量呈负相关关系。除玉米根系数量外,5-AC处理单苗干质量与株高、根长和根系数量均呈正相关关系。玉米的根系数量与5-AC呈负相关关系,但相关系数较低,仅为-0.167 9。结果表明,丁酸钠和5-AC对植物顶端生长点与侧向器官发生组织具有不同的影响。3 结论与讨论丁酸钠是一种表观遗传调控试剂,但关于丁酸钠对植物生长发育的调节效应报道较少。结果表明,丁酸钠和5-AC处理整体上抑制株高增加、根系伸长以及干物质的积累

19、,丁酸钠处理对根系数量的发生有一定的促进效果,但 5-AC处理表现为低浓度促进根系数量的发生,而高浓度抑制根系数量的发生。说明丁酸钠和5-AC这2种表观遗传试剂在种子萌发过程引起的表型效应具有相似性,但在植物顶端生长点与侧向器官发生组织中的作用存在差异。前人的研究发现,5-AC对植物生长发育的调控效应与其处理浓度有关8-10。通过5个处理浓度的5-AC对4种禾本科作物进行比较也进一步证实5-AC对植物生长发育调节具有浓度效应。低浓度的5-AC对作物某些器官的发生具有促进效应,而高浓度的5-AC对某些器官的发生具有抑制作用。丁酸钠和5-AC处理均抑制株高、根系的生长及干物质的积累,但5-AC的危

20、害较重;丁酸钠溶液处理能促进作物根系数量的发生,而5-AC处理后的促进效应明显不如丁酸钠处理。由此可见,丁酸钠和 5-AC对植物的调控效应并不完全相同。通过本试验结果可推测,丁酸钠溶液和低浓度的5-AC可能通过抑制根尖生长点和茎尖生长点细胞的生长和分化,促进侧向器官组织细胞的活动。丁酸钠抑制组蛋白去乙酰化酶的活性,提高组蛋白乙酰化水平,从而激活基因表达13。有研究认为,丁酸钠也能降低基因组甲基化水平,激活基因表达14。一般认为,5-AC能降低基因组DNA甲基化水平,从而激活基因的表达15。此前,5-AC对植物的生长发育效应8,10-11、促进植物开花15、提高植物抗逆性7方面已经有了一些研究,

21、结果显示,植物基因组的甲基化水平有所下降。但关于5-AC在不同组织中的效应报道较少。Kruh认为,丁酸钠能作用于不同位置的细胞,但专一性很低16。从本研究结果来看,丁酸钠对不同位置细胞具有不同的调控效应。本研究发现,低浓度5-AC处理对茎尖生长点和侧向器官形成细胞具有不同的调控效应,而高浓度的 5-AC 抑制了侧向器官的形成。因此,丁酸钠和5-氮杂胞苷对不同组织的调控效应有待进一步深入研究。HS2*2HT8.5HReference:1 Yuan L Y,Liu X C,Luo M,et al. Involvement of histone modifications in plant abio

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23、 histone H4 acetylation and a decrease in global DNA and H3K9 methylation during mitosis in maizeJ. BMC Plant Biology,2010,10(1):224-227.5Chinnusamy V,Gong Z,Zhu J K. Abscisic acid-mediated epigenetic processes in plant development and stress responsesJ. Journal of Integrative Plant Biology,2008,50(

24、10):1187-1195.6徐延浩,侯澤豪,张文英,等. 5-氮杂胞苷和丁酸钠对大麦苗期耐湿性的影响J. 广东农业科学,2015,42(24):26-30.7Zhong L,Xu Y H,Wang J B. The effect of 5-azacytidine on wheat seedlings responses to NaCl stressJ. Biologia Plantarum,2010,54(4):753-756.8陈 芳,王子成. 5-氮杂胞苷对小麦生长发育及DNA甲基化的影响J. 河南大学学报(自然科学版),2011,41(1):61-66. 9李梅蘭,曾广文,朱祝军. 5-氮胞苷(5-azac)和赤霉素(GA3)对白菜开花的影响J. 上海交通大学学报(农业科学版),2002,20(2):125-128,136.10 汪炳良,李水凤,曾广文,等. 5-azac对萝卜茎尖DNA甲基化和开花的影响J. 核农学报,2005,19(4):265-268.11杜丽丽. 5-azac对菠菜生长发育及DNA甲基化的影响D. 新乡:河南师范大学,2011.12梁海曼,方国伟. 丁酸钠预培养对水稻花药绿苗形成的影响J. 浙江大学

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