DNA重组技术基本工具课件

1、专题1 基因工程1-1 DNA重组技术的基本工具第1页，共33页。基因工程的概念基因工程：指按照人们的愿望,进行严格的设计并通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性,创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫作DNA重组技术或基因拼接技术。第2页，共33页。基因工程的别名操作环境操作对象操作水平基本过程原理目的基因拼接技术或DNA重组技术生物体外基因DNA分子水平定向改造生物的遗传性状剪切 拼接 导入 表达基因重组基因工程的概念理解第3页，共33页。问题探讨： 苏云金芽孢杆菌含有一种可以合成毒蛋白的基因。让细菌的毒蛋

2、白基因在棉花细胞中表达，可培育出抵抗棉铃虫害的抗虫棉。想一想：需要做哪些关键工作？普通棉花抗虫棉第4页，共33页。基因工程培育抗虫棉的简要过程：苏云金芽孢杆菌提取抗虫基因普通棉花(无抗虫特性)棉花细胞(含抗虫基因)与运载体DNA拼接，导入棉花植株(有抗虫特性)表达第5页，共33页。基因工程培育抗虫棉的关键步骤：关键步骤一：抗虫基因从苏云金芽孢杆菌细胞内提取出来关键步骤二：抗虫基因与运载体DNA“缝合”关键步骤三：抗虫基因进入棉花细胞第6页，共33页。解决培育抗虫棉的关键步骤需要哪些工具？“分子手术刀” 限制性核酸内切酶“分子缝合针” DNA连接酶“分子运输车” 基因进入受体细胞的载体第7页，共

3、33页。1-1 DNA重组技术的基本工具“分子手术刀” 限制酶 “分子缝合针” DNA连接酶 “分子运输车” 基因进入受体细胞的载体 第8页，共33页。识别双链DNA 分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。主要从原核生物分离纯化出来4000种。 1、来源： 2、种类：3、作用：5、结果：形成两种末端一、“分子手术刀” 限制性核酸内切酶黏性末端平末端4、切割方式：错位切和平切第9页，共33页。ATGCATGC限制酶切割磷酸二酯键第10页，共33页。限制性内切酶作用过程点击播放第11页，共33页。 1、大肠杆菌的一种限制酶（EcoR)能识别GAATT

4、C序列，并在G和A之间切开形成黏性末端。 2、Sma能识别CCCGGG序列，并在C和G之间切割形成平末端 。常见的两种限制酶第12页，共33页。Sma平末端平末端第13页，共33页。EcoR黏性末端黏性末端第14页，共33页。什么叫黏性末端？ 当限制酶从识别序列的中心轴线两侧切开时，被限制酶切开的DNA两条单链的切口，带有几个伸出的核苷酸，他们之间正好互补配对，这样的切口叫黏性末端。第15页，共33页。什么叫平末端？ 当限制酶从识别序列的中心轴线处切开时，切开的DNA两条单链的切口，是平整的，这样的切口叫平末端。第16页，共33页。寻根问底你能推测限制酶存在于原核生物中的作用是是什么吗？ 原核

5、生物易受自然界外源DNA的入侵，但生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制，以防止外来病原物的侵害。限制酶就是细菌的一种防御性工具，当外源DNA侵入时，会利用限制酶将外源DNA切割掉，以保证自身的安全。所以，限制酶在原核生物中主要起到切割外源DNA、使之失效，从而达到保护自身的目的。第17页，共33页。为什么限制酶不剪切细菌本身的DNA？ 通过长期的进化，细菌中含有某种限制酶的细胞，其DNA分子中或者不具备这种限制酶的识别切割序列，或者通过甲基化酶将甲基转移到所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。这样，尽管细菌中含有某种限制酶也不会使自身的DNA被切断，并且可以防止外源DNA的入侵。

6、 寻根问底第18页，共33页。1、要想获得某个目的基因必须要用限制酶切几个切口？可产生几个黏性末端？一个目的基因有几个黏性末端？要切两个切口，产生四个黏性末端，两个。2、如果把两种来源不同的DNA用同一种限制酶来切割，会怎样呢？ 会产生相同的黏性末端。3、是不是把两者的黏性末端黏合起来，这样就真的合成重组的DNA分子了? 实际还不够,还需要DNA连接酶进行连接。思考与探究第19页，共33页。ATGCATGC连接酶连接磷酸二酯键DNA连接酶的作用过程：二、分子缝合针DNA连接酶第20页，共33页。作用部位：是磷酸二酯键（扶手）不是氢键（梯子） DNA连接酶将两条DNA链连接起来的酶。第21页，共

7、33页。类型EcoliDNA连接酶T4DNA连接酶来源功能大肠杆菌T4噬菌体恢复磷酸二酯键只能连接黏性末端能连接黏性末端和平末端(效率较低)相同点差别连接酶种类：第22页，共33页。两DNA片段要具有互补的黏性末端才能拼起来DNA连接酶的缝合作用可把黏性末端之间的缝隙“缝合”起来，注意：DNA连接酶可连接双链DNA中的DNA单链缺口，但不能连接单链DNA！第23页，共33页。DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗？T4 DNA连接酶还可把平末端之间的缝隙“缝合”起来，但效率较低DNA连接酶的缝合作用第24页，共33页。A A T T GCAATTAATTDNA聚合酶DNA聚合酶DNA聚合酶DNA

8、聚合酶DNA聚合酶DNA聚合酶的作用第25页，共33页。DNA连接酶DNA聚合酶相同点作用实质化学本质不同点模板作用对象 作用结果用途都能催化形成磷酸二酯键都是蛋白质不需要需要形成完整的重组DNA分子形成DNA的一条链基因工程DNA复制DNA连接酶与DNA聚合酶的比较只能将单个核苷酸连接到已有的DNA片段上，形成磷酸二酯键在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键第26页，共33页。1、外源基因(如抗虫基因)怎样才能导入受体细胞(如 棉花细胞)？“分子运输车”载体。2、载体的作用有哪些？作用一：作为运载工具，将外源基因(抗虫基因)转移到受体细胞(棉花细胞)中去。作用二：利用载体在受体细胞(棉花细胞)内

9、，对外源基因(抗虫基因)进行大量复制。（随载体的复制而复制）三、基因进入受体细胞的载体第27页，共33页。“分子运输车”载体常用的载体主要有两类： 1）细菌细胞质的质粒 2）噬菌体或某些动植物病毒原理：病毒，细菌等的侵染性。第28页，共33页。认识常用的载体质粒 质粒主要存在于细菌和酵母菌体内。 质粒是一种裸露的、结构简单、独立于染色体或细菌拟核之外，能自我复制的小型环状双链DNA分子。第29页，共33页。质粒的特点：1、细菌染色体外双链环状DNA分子2、能自我复制并在受体细胞中稳定存在3、有一个或多个限制酶切点4、有特殊的遗传标记基因第30页，共33页。议一议2、能否用SARS病毒作为基因载体？3、作为载体，若没有切割位点将怎样？4、携带目的基因的载体是否进入了受体细胞，如何鉴定？5、假如目的基因导入受体细胞后不能复制，将怎样？1、从化学组成来看，载体应含有什么成分？双链DNA不能不能进行DNA的重组载体上应有标记基因可能造成基因丢失第31页，共33页。1）能够在宿主细胞中自我复制并稳定地保存。2）具有一个或多个限制酶切点，以便与外源基因连接。3）具有某些标记基因，便于进行筛选。4）必需是安全的，不会对受体细胞有害。5）大小应适合，便于提取和操作 作为运载体的必要条件注意：真正用作运载体的质粒都是人工改造过的第32页，共33页。小结：