ELISA原理、方法、操作及影响因素课件

1、酶联免疫吸附试验（ELISA)第1页，共42页。主要内容一、原理二、酶免疫测定操作步骤三、抗原、抗体的检测方法四、影响ELISA测定的因素第2页，共42页。一、原理（一）酶免疫技术简介1971年由瑞典学者Engra11和Per1mann,荷兰学者Vanweeman和Schuurs报道。开创了运用酶标记免疫技术进行液体标本中微量物质测定的实验方法。第3页，共42页。一、原理（二）ELISA原理1） ELISA的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性2）在测定时，受检标本（测定其中的抗原或抗体

2、）与固相载体表面的抗原或抗体反应，用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中其他物质分开第4页，共42页。3）在加入酶标记的抗原或抗体，也通过反应而结合在固相载体上，此时固相载体上的酶量与标本中受检物质的量呈一定比例4）加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，则可根据颜色的深浅进行定性或定量分析5）在ELISA方法中有三个必要试剂 固相载体的抗原或抗体，即“免疫吸附剂” 酶标记的抗原或抗体，称为“结合物” 酶反应的底物，即“显色剂”第5页，共42页。第6页，共42页。二、酶免疫测定操作步骤（一）标本的收集、运送和保存（二）试剂准备（三）加样

3、（四）温育（五）洗板（六）显色（七）比色（八）结果判读第7页，共42页。操作示意图第8页，共42页。（一）标本的收集、运送和保存ELISA法中主要以血清为标本，血清标本按常规方法采集，应注意避免溶血，因红细胞溶解释放出的具有过氧化物酶活性的物质对结果有影响。第9页，共42页。（二）试剂准备三个必备试剂：1）固相抗原或抗体2）酶标抗原或抗体3）酶反应底物第10页，共42页。（三）加样在ELISA中一般有3次加样步骤，即加标本、加酶结合物、加底物。在加入血清标本后，可在微型振荡器上振荡1分钟以保证混匀，加入酶结合物时，应使加液过程迅速完成。第11页，共42页。（四）温育目前常用的温育时间和温度为3

4、7 30分钟1小时，温育时间过短或温度不够可影响反应物结合，从而影响结果第12页，共42页。（五）洗板保证每孔都被洗到，ELISA是靠洗涤来达到分离结合与未结合抗原抗体复合物及酶标记物的目的，同时洗涤也可将非特异吸附的干扰物质清除掉第13页，共42页。（六）显色一般显色时间并非试剂盒规定的时间，因为试剂盒的吸光度值会受环境中的温度、湿度、酶标板反应时所接触的物品等有关，实验操作人员在加完显色液后，可根据颜色深浅适当延长或缩短显色时间第14页，共42页。（七）比色比色前应先用洁净的吸水纸拭干板底附着的液体，然后正确放入酶标比色仪中。第15页，共42页。三、抗原和抗体的检测方法（一）抗原测定：双抗

5、体夹心法 双位点一步法 竞争法（二）抗体测定：间接法 双抗原夹心法 竞争法 捕获法第16页，共42页。（一）抗原测定双抗体夹心法1）双抗体夹心法只适用于二价或二价以上的大分子抗原的测定2）形成固相抗体待测抗原酶标抗体复合物3）常用于：乙肝表面抗原、甲胎蛋白、HCG等检测第17页，共42页。第18页，共42页。（一）抗原测定双位点一步法1）针对抗原分子上两个不同且空间距离较远的决定簇的两种单克隆抗体，即包被使用一种单克隆抗体，酶标使用另外一种单克隆抗体，两种抗体互不干扰。第19页，共42页。第20页，共42页。（一）抗原测定竞争法1）主要用于检测小分子抗原2）先将抗体包被固相载体上，然后同时加入

6、待测抗原和酶标抗原，待测抗原与酶标抗原竞争与固相抗体结合，温育、洗涤加入酶底物显色3）显色颜色深浅与待测抗原成负相关第21页，共42页。第22页，共42页。（二）抗体测定间接法1）将抗原包被在固相载体上，加入待测样本，使样本中待测抗体与固相载体上的抗原结合，加入酶标二抗（抗抗体物），在固相载体上形成固相抗原待测抗体酶标抗抗体复合物，加入底物显色2）常用于：丙型肝炎抗体、人免疫缺陷病毒抗体等第23页，共42页。第24页，共42页。（二）抗体测定双抗原夹心法1）双抗原夹心法适用于大分子抗体2）形成固相抗原待测抗体酶标抗原复合物3）常用于测定乙型肝炎表面抗体等第25页，共42页。第26页，共42页。

7、（二）抗体测定竞争法1）主要针对小分子抗体2)先将抗原包被固相载体上，然后同时加入待测抗体和酶标抗体，待测抗体与酶标抗体竞争与固相抗体结合，温育、洗涤加入酶底物显色，显色颜色深浅与待测抗体成负相关。3）常用于测定乙肝核心抗体、乙肝e抗体第27页，共42页。第28页，共42页。（二）抗体测定捕获法1）主要用于血清中某种抗体亚型（如lgG、lgM、lgA)成分的测定，目前最常用的是病原性感染诊断中的lgM型抗体第29页，共42页。第30页，共42页。四、影响ELISA测定的因素（一）试剂盒的因素（二）标本的因素（三）实验操作的因素第31页，共42页。（一）试剂盒的因素1）固相材料：聚苯乙烯塑料2）

8、抗原：纯化、合成和基因工程抗原3）抗体：多抗、单抗和基因工程抗体第32页，共42页。（一）试剂盒的因素4）酶结合物：酶免疫测定的核心成分5）色原底物：OPD和TMB6）运输贮存第33页，共42页。第34页，共42页。（二）标本的因素1）内源性干扰因素：类风湿因子、补体、异嗜性抗体、治疗性抗体、溶菌酶、磷脂、药物小分子、总蛋白浓度等2）外源性干扰因素：溶血、细菌污染、标本贮存时间过长、凝固不全、反复冻融第35页，共42页。（三）实验操作因素第36页，共42页。（三）实验操作的因素加样1）加样不可太快，避免加在孔壁上部，不可贱出和产生气泡。2）从滴瓶中滴加试剂，除了要注意滴加角度外，滴加速度也很重

9、要，滴加太快，很容易出现重复滴加或加在两孔之间的现象，这样就会在孔内的非包被区出现非特异吸附，从而引起非特异显色第37页，共42页。温育1）常采用的温育温度有43、37、室温和4等2）温育所需时间与温度成反比，即温育温度高，则所需时间相对较短3）温育时，微孔板应置于水浴（浮于水面）或湿盒中，以使反应溶液的温度迅速与温育温度平衡4）“边缘效应”的排除第38页，共42页。洗板1）每次温育后洗板是否彻底，与非特异背景显色有很大关系2）洗液一般为含0.05%吐温的中性PBS（磷酸盐缓冲液）3）洗板液中吐温浓度高于0.2%，可使包被于固相载体上的抗原或抗体解吸附而影响试验测定下限第39页，共42页。显色1）加入底物A和B后，应振荡混匀2）当底物为OPD时，显色反应应避光进行3）一般商品试剂盒显色反应条件为37或室温反应1530min，从理论上说，37