CTAB-硅珠法提取DNA实验流程

1、)溶液于烧杯中，均CTAB 硅珠法提取 DNA 实验流程前言 :实验是要求非常严谨的过程 , 每个一步骤都可能对后面的操作产生很大影响果 . 一步错 , 步步错 , 每一个操作的失误都可能导致整个实验的失败 事实求是与踏踏实实的作风是每个做实验的人必备的基本品质. 永远记住, 乃至影响后面的结, 任何弄虚作假的行为都是可耻的 .在这个充满学术腐败的科学界,保持自己的纯真 .谨记1. 材料的采集采取植物的嫩叶 ,可以用硅胶干燥保存 , 也可以用冰袋 , 主要是防止叶片组织的降解及叶片的褐化 .用泡沫塑料箱子带回 , 置于 -70 冰箱保存 .2.CTAB 硅珠法提取 DNA 实验流程各加入液体的

2、配制：1 、 CTAB 提取液：2% （ W/V g/mol ） CTAB ；5% （ W/V g/mol ） PVP ；1.4mol/lNaCl ；20mmol/L EDTA PH=8.0 ；l00mmol/l Tris-HCl PH=8.0 ；2%(V/V) 巯基乙醇 ( 临时加入 )配制量： 500ml配制方法：(1) 计算所需组分量 CTABPVPNaClEDTA.Na2.2H2OTris10g 需热磁力搅拌25g40.908g3.7224g 调 PH=86.057g(2) 称取 CTAB 10 g ， NaCl 40.908g ， PVP 25g(3) 加入约 300dd H2O(

3、双蒸水 ) 充分磁力搅拌溶解冷却为常温时 ( 母液 )置于 500ml 烧杯中( 注意： EDTA 和 PVP 较难溶，加热溶解的同时用热磁力搅拌直至完全的透明为止(4) 量取 20mlEDTA(0.5mol/l PH=8 ) ， 50ml Tris-HCl(1 mol/l PH=8) 匀混合(5) 将烧杯溶液定容至 500ml 后，高温高压灭菌(6) 室温保存。0.5mol/LEDTA 配制组分浓度： 0.5mol/l EDTA ， PH=8配制量： 500ml配制方法 (1) 称取 93.06 克 EDTA.Na2.2H2O ，置于 500 ml 烧杯中(2) 加入约 400ml dd H

4、2O. 用热磁力搅拌器充分搅拌(3) 用 NaOH 调节 PH 值到 8 ，约用 10 克固体 NaOH(4) 在溶液冷却后，再用 NaOH 调节至 PH=8(5) 加 dd H2O 将溶液定容到(6) 高温高压灭菌后，室温保存NaOH 溶液的配制组分浓度： 5 mol/l NaOH配制量： 100 ml配制方法 (1) 称取固体 NaOH20 (2) 加入 dd H2O 定容到 100 ml100 mmol/l Tris-HCl 的配制500 ml克于容器中组分浓度： mmol/l Tris-HCl ， PH=6.4配制量： 250 ml配制方法 (1) 称取 3.025 克 Tris 于

5、250 ml 烧杯中 .(2) 加入约 200ml dd H2O(3) 用浓盐酸调节 PH 值到(4) 将溶液定容至 250ml充分搅拌溶解 .6.4. 所用浓盐酸约 3 ml(5) 用棕色瓶分装于 4 度冰箱中(6) 如使用，用水浴加热溶解 .2 、氯仿 - 异戊醇的配制：配制方法 (1) 简单的体积混合，既要求比例为 24： 1 即可(2) 储存于棕色玻璃瓶子中(3) 置于 4 度冰箱以便日后使用3 总的实验流程3.1 总的 DNA 的提取：1. 在 10ml 离心管（ eppendorf 管）中加入 4mlCTAB 提取液及 80ul 巯基乙醇，在 65 水浴锅中预热2. 取材料 1-2

6、g 于研钵中，加入适量液氮迅速多次研磨成细粉状，转至预热的中，用封口膜将离心管封密以防止巯基乙醇挥发 . 放回水浴中保温 30次，保持摇匀 .CTAB 提取液分钟，保温过程中轻晃几3. 取出 Eppenedorf 管 . 置于冰上迅速冷却到室温， 轻微混合均匀且充分，使其彻底地混合成乳状液，然后加入等体积的 4ml 氯仿 - 异戊醇（ 24： 1 ），4 下离心 12000rpm 10min ，轻轻将上清液吸取 1ml 于 1.5ml 离心管，放于 -20 冰箱中备用 .各加入液的用途：（1 ）去污剂：CTAB ：可将细胞膜裂解，使 DNA 释放到提取液中，同时也使组织匀浆中的蛋白质变性 .E

7、DTA ：能与 DNase 的辅助因子 Mg2+ 结合，使 DNase 失去活性，不能降解从细胞中释放的DNA.（2 ）还原剂巯基乙醇：它抑制从细胞中释放的多酚氧仿 . 防止植物组织发黄变褐 .（3 ）氯仿 异戊醇：它可把组织匀浆中变性的蛋白质除去，将 DNA 与细胞中的蛋白质、碳水化合物等分开除去 .（4 ） RNase ：它可去除核酸中的 RNA ，只留下 DNA.3.2 总 DNA 的纯化 操作步骤：1. 取出 1.5ml 离心管，内含所取 DNA ，加入 100ul 硅珠悬浮液（此液要求先行涡旋再使用） ，使用涡旋振荡器大约 15s ，使之充分混匀， 于室温静置 10 分钟，再振荡15

8、s 4 度，去除上清液得到硅珠 核酸复合物 .2. 将复合物用镊子一次打两个，打成液状，使之完全分散，加入漂洗液匀，后离心 8000rpm 15s 弃掉上清液 .3. 重复上一步一次 .5 秒，后离心： 8000rpm1ml ，再涡旋充分混4.用 70% 的 1ml 乙醇将硅珠 核酸复合物漂洗两次 . 每次涡旋充分混匀后，离心8000rpm 15s ，弃上清液， 打散，最后用 1ml 无水乙醇再漂洗一次， 用涡旋混匀离心15s ，然后将离心管管口打开倒置在吸水纸上，再将沉淀置于真空冷冻干燥机中风干复合物 分钟 .8000rpm105. 加入 100ulTE 缓冲液充分混匀后，于 5min. 取

9、上清液即为所需的 DNA.6. 将余下的复合物再次完全打散（即涡旋）56 度水浴中保温 10 分钟，然后离心 12000rpm，加入 100ulTE 缓冲液进行第二次重旋，并于56 度水浴中保温 10min ， 12000rpm 5min ，取上清液于步骤 5 管中共存 .7. 将两次二合一的上清液离心混匀 14000rpm 10min ，取上清液存于 -20 冰箱中 . 仪器的使用真空干燥器：在使用前要求先预热 30 分钟，只打开打开盖子平衡放入离心管，然后顺次开启 分钟 .1 号阀门 .2 号 3 号 4 号 5 号门 . 进行干燥处理 5关闭各阀门 . 顺序为 5 号 4 号 3 号 2

10、 号 1 号阀门 .各加入液的配制1 、硅珠悬浮液的配制（1 ） 称取 1.2g 硅珠粉，溶解于 10ml 无菌水中 .（2 ） 放入 4 冰箱备用 .（3 ） 使用时先涡旋使其混合均匀 .2 、漂洗液的配制称 取GuSCN （ 可 能 产 生 有 毒 气 体 ， 要 求 在 通 风 橱 中 进 行 ） 120 克 溶 解 于100mlTris-HCl(100mM PH6.4) 中 . 要求在 60 水浴中溶解 .3 、 TE 缓冲液的配制10 TE， 500ml 配制如下：将 100mM Tris-Hcl （ PH=8.0 ） 6.057g 与 10mM EDTA （ PH=8.0中，调 P

11、H=8.0 ，定容到 500ml 。3.3.DNA 取 4ul DNAD280nm估测其纯度样品浓度、纯度测定水溶液用双蒸水稀释到 400ul ，用紫外分光光度计测定其值 . 根据 D260nm 值估测浓度。根据 D260nm/D23Onm.） 1.8612g 溶于 400ddH2OD23Onm 、 D260nm 、 D260nm/D280nm 值（1 ）浓度计算公式：对于双链 DNADNA 样品的浓度（ ug/ml（2 ） 纯度估测标准： 纯的 DNA2.0而言 D260nm 为 50ug/ml） = D260nm 稀释倍数 50/1000溶液其 D260nm/D280nm=1.8 ； D2

12、60nm/D23Onm DNA 浓度的精确测定：去除一定量的 DNA ，稀释成 200ug/ul 标准 DNA 和样品各 1ul ，进行 0.8% 并对 DNA 样品进行定量、调整样品的，配制少量 400 的琼脂糖凝胶电泳、 200 、 100 和 50 ng 的 DNA. 取. 紫外灯下比较样品 DNA 条带的亮度，DNA 的量与 100ug DNA 的亮度相一致 .总的 DNA 跑出来条带在紫外光下看应该是明亮的一条分降解或提纯的不彻底 , 含有的 RNA 较多 . 虽然 SSR带 , 还须实验证明 , 或重新提取 .2.PCR 扩增SSR-PCR 扩增反应体系,没有拖尾的现象 ,若有的话

13、可能 DNA 部对模板的要求不是太严格 , 具体能否扩出条1 、 10ul 反应体系：调温高压灭菌水 H2O 5.45ul 5.45ul a 5.45ul a b10 Buffer 1ul 1ul a 1ul a b2mM-dNTP 1ul 1ul a 1ul a b25mu-MgCl2 1ul 1ul a 1ul a br-T aq 0.05ul 0.05u a l 0.05ula bPrimer+ 0.25ul 0.25ul a 0.25ul abPrimer-DNA 模板0.25ul1ul0.25ul a0.25ul ab说明： a 个反应量 = 不同模板 n+2 ， b 为引物数 +2

14、2 、作程序及其注意事项：1) 分装各型枪头 .2) 分装各型离心管 .3) 顺次用碳笔标明引物号，小 master 顺序号及总4) 收取冰块半盘，将取出各液放于冰上 .5) 配总 master ，先计算好 a b6) d-NTP 和 MgCl2 要求加样前先轻微涡旋混匀，7) 配 master 的顺序： H2O BufferdNTP8) 轻涡旋总 Master9) 分装 C 个引物个小 Master10) 向 C 个小 Master 加入 C 个引物11) 将含引物的 C 个 Master 涡旋混匀master 顺序号 .、Taq 酶要求在冰箱口取用 .MgCl2T aq12) 将 N 个模

15、版点加到 N C 个小离心管中，各含 1ulDNA13) 将各小 Master ，每 9ul 加入到含 1ulDNA 的离心管中14) 时刻注意更换枪头，防止交叉感染，尽量不要将枪头放在液面下 .15) 将扩增好的 DNA 进行溴酚蓝点样，每离心管 8ul3 、各加入液的配制（1 ） 引物的稀释1) 每管引物先 1000rpm 3min 进行离心，将附在管壁上的粉末或膜状物离心到底部，小心打开 盖子 .2) 加入经高温高压的灭菌水 . 针对不同的引物加入不同的量3) 使最终浓度都为 10um/L （2 ） 溴酚蓝的配制1) 将 0.125 克溴酚蓝， 20 克蔗糖溶解为 50ml 的 ddH2

16、O2) 再进行过滤3) 放于 4 冰箱中储存 （3 ） Buffer 的配制1 ） 1 TE Buffer组成浓度： 10mM Tris-HCl 1mM EDTA PH=8.0配制量： 500ml配制方法：量取下列溶液于 500ml 烧杯中1M Tris-HCl Buffer PH=8.0 5ml0.5M EDTA PH=8.0 1ml向烧杯中加入约 400mldd H2O 均匀混合；将溶液定容到 500ml 后，高温高压灭菌；室温保存 .2 ） 10 TE Buffer组成浓度： 100mM Tris-HCl 10mM EDTA PH=8.0配制量： 1000ml配制方法：量取下列溶液于 1

17、 升烧杯中：1M Tris-HCl Buffer PH=8.0 100ml ；0.5M EDTA PH=8.0 20ml向烧杯中加入约 800mldd H2O 均匀混合；将溶液定容到 1 升后，高温高压灭菌；室温保存 .1MTris-HCl 的配制：组分浓度： 1M PH=7.4 7.6 8.0配制量： 500ml配制方法： 称取 6.057 克 Tris按下表量加入浓盐酸调节所需置于 500ml 烧杯中； 加入约 400ml 的 dd H2O 充分搅拌溶解；PH 值PH 值 浓盐酸量7.4 35ml7.6 30ml8.0 21ml将溶液定容到 500ml ；高温高压灭菌后，室温保存 .PCR

18、 反应体系1 、本实验样品所采用的反应程序：2 、 PCR 扩增仪的操作：1 ）先通过观察哪个指示灯是空的扩增仪2 ）右旋打开盖子，按顺序摆放并用手柄轮压实3 ）做旋盖好盖子至刻度处4 ）打开操作程序，选好人名反应体系并逐一确定5 ）掌握扩增仪时间 2:30 降温需 30 分钟聚丙烯酰胺凝胶电泳 PAGEPAGE 操作流程及注意事项：1 、涂胶1 ） 将有耳玻片（耳朝下）泡于反硅化剂中，新液 25 分钟，旧液 30 分钟 .2 ） 涂无耳正面玻片硅化剂 .均匀点四滴，轻而匀的沿一个方向涂三次，静 10 分钟 .3 ） 到时间取出 . 打开通风橱风干 30 分钟 .2 、封胶1 ）2 ）3 ）4

19、 ）将两玻片对贴于橡胶框中，放平，用力拧死，夹住橡胶管 .溶废琼脂胶，分两次：第一次 50 秒，第二次 10-20 秒，防止沸出 .用小细长枪头通透加胶枪头，便于加样通畅，少起气泡 .吸 2500-3000ul 液胶加速沿玻片边缘快速顺下滴，将两面玻片充分封死，防止漏胶. 以水平底线面水平高于底为佳，静止凝胶 15 分钟 . （有时可先在封口加一点 TBE 以润滑玻片，利于胶流下）3 、灌胶1) 用长细枪头透开加胶枪头2) 从中间加入，每次不要全部打完，留一点在枪头内 . 防止断流而导致胶中含有气泡 .3) 插梳子时两端平整，梳子紧贴玻板，梳齿头部不可有气泡 .4) 拔梳子时先加一倍 TBE

20、液将梳子泡透，然后平行用力拔出 .5) 在插梳子 15 分钟内跟踪观察，适当下按，保证孔的深度 .6) 等待 2 小时，以便胶充分凝固 .4 、吹孔1 ） 向中间槽加入 1 倍粗制 TBE ，要淹没过内玻片约 1 厘米 .2 ） 拔梳子，小心平稳，均匀平衡 .3 ） 调 1000p 枪到 300-600ul ，进行吹孔，将小孔内沉淀物吹打干净，加样中再视时吹孔 .5 、加样1 ） 用细长专用枪加入 DNA 0.5ul.2 ） 一手托另一臂的肘，以保证加样手不抖 .3 ） 一定垂直加到孔中去，不脱尾，不吸水，不靠壁，干净利落 .4 ） 加完一次 . 在放于桌旁的吸纸上，将细枪头上余液吸干 .5

21、） 首、中、尾各留 1 到 2 个孔，两面胶孔的 Marker 不完全一样，以便区分 .6 ） 加 Marker 0.15ul 一般取 0.3ul 每孔注如一半，可用两个孔 .6 、跑胶1) 向两侧槽中加入粗制 TBE ，至 U 管线处 .2) 打开电源，稳压到 120V3) 电泳 2h 左右4) 当样品跑到底部 2cm 处，关闭电源 . 7 、撬玻片1 ） 刀片不伸入过深 .刀片平行于玻片，稍用力 .2 ） 将没有硅化剂的无耳玻片放于水盘中，还有梳子 .3 ） 清理琼脂胶，放于烧杯中 .4 ） 胶玻片放于盘中，银染 .各加入液的配制1 、反硅化剂的配制1 ） 量取 500ml ddH2O.2 ） 用冰乙酸把 ddH2O PH 调至 3.5.3 ） 再加 Bind-silica 2ml.4 ） 用热磁力搅拌器搅拌均匀 .2 、 TBE 电泳母液（ 10 ）的配制1 ） 分别称取 54 克 Tris 碱， 27.5 克硼酸， 20ml 0.5mol/EDTA （ PH=8.0 ）2 ） 将各组分别加入 1 升烧杯中，用 ddH2O 定容到 1 升 .3 ） 在电泳时使用 1 倍工作液，按 1： 4 与水混合 .4 ） 1 倍液是为了增加电泳工作液的电流的电流量 .5 ） 盛于玻璃瓶，在室温保存 .3 、聚丙烯酰胺的配制（ 8% ）组分浓度： 80%配制量： 500ml配制方法：量