梨果皮色泽变异品种(系)的AFLP与SRAP标记鉴定

1、梨果皮色泽变异品种(系)的AFLP与SRAP标记鉴定论文摘要：本试验利用AFLP和SRAP标记对3组果皮色泽的变异品种Table1Cultivarsorstrainsusedinthisstudy 编号 No. 品种或株系 Cultivars(strains) 外观色泽 Colour of appearance 样品采集地 Place of sample collection 1 南果Nanguo 绿色 green 辽宁Liaoning 2 南果红色变异系 Red variant strain of Nanguo 红晕 red flush 辽宁Liaoning 3 考密斯 Doyenne du

2、 Comice 绿色 green 南京Nanjing 4 红考密斯 Red Doyenne du Comice 紫红色 dark red 南京Nanjing 5 早红考密斯 Early red Doyenne du Comice 紫红色 dark red 河北 Hebei 6 早红考密斯绿色变异系Green variant strain of Early red Doyenne du Comice 绿色 green 河北Hebei 7 红安久Red dAnjou 红色 red 河北Hebei 8 红安久绿色变异系Green variant strain of Red dAnjou 绿色gree

3、n 河北Hebei 1.2试验方法采用改进CTAB法提取基因组DNA，利用核酸分析仪检测DNA的浓度，0.8%琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量，并根据实验需要进行合理稀释，于-20保存备用。反响体系参考LuisaMonte-Corvo的研究，并结合本试验材料进行合理优化，试验采用三碱基选择性引物，引物序列参照李元军，引物合成由英潍捷基上海贸易完成，MseI/EcoRI内切酶和T4DNA连接酶均购于纽英伦生物技术北京。酶切反响体系为20L，DNA模板2L、NEBBuffer2L、BSA100 x0.3L、MseI0.5L、EcoRI0.3L、ddHO14.9L，37下酶切5小时，置于6515min；

4、连接反响是将EcoRIadapter1L、MseIadapter1L、TBuffer1L、ddHO1.5L混合后参加酶切产物中，连接12小时,置于6515min。选择性扩增的PCR产物采用6%聚丙烯酰胺凝胶电泳别离，银染显色，以获得电泳图谱。SRAP引物序列参照路娟的研究，PCR反响体系采用本试验室优化的体系。取4LPCR产物于1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，假设与预期片段大小相近且条带清晰，再通过8.0%的变性聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)别离，银染后观察、拍照。1.3数据统计与处理对于同一引物的扩增产物，有带记为1;，无带记为0;，弱带及分辨不清的条带忽略不计。将数据录入Excel表格，形成二元矩

5、阵，根据Nei和Li计算相似系数，用NTSYSpc2.02软件中的SHAN程序对色泽变异品种(系)进行聚类，并作聚类图。2结果与分析2.1基因组DNA扩增结果利用64对AFLP引物组合对供试品种进行PCR扩增，其中54对引物扩增出稳定、清晰的条带，扩增条带大小范围在100500bp之间，局部引物扩增的电泳图谱如图1。对扩增条带的统计结果分析说明，54对引物在3组色泽变异品种及株系中共检测1089个位点，平均每对引物检测位点数为20，其中多态性条带数为688，多态性比率为63.2%。采用30对SRAP引物组合对供试品种进行检测，有20对引物可扩增稳定、清晰的条带，扩增产物大小在1001000bp

6、范围内，局部扩增条带如图2。对扩增条带的统计分析说明，20对引物在3组色泽变异品种及株系中共检测210个位点，平均每对引物检测位点数为10.5，其中多态性条带为76条，多态性比率为36.2%。2.2AFLP标记鉴定色泽变异品种54对AFLP引物组合在南果与南果红色变异系中可扩增条带数为1035条，可检测的多态性条带为7条，占总条带数的0.64；考密斯及其色泽变异的4个品种Fig.1GeneticdifferencerevealedbydifferentAFLPprimerpairs18.Differentcultivarsoraccessions(codessequenceshownasTab

7、le1)2.3SRAP标记鉴定色泽变异品种20对SRAP引物组合在南果与南果红色变异系中可扩增条带数为198条，可检测的多态性条带为3条，占总条带数的1.43；考密斯及其色泽变异4个品种Fig.2GeneticdifferencerevealedbydifferentSRAPprimerpairs18.Differentcultivarsoraccessions(codessequenceshownasTable1)的4个品种系中3对引物能区分其中的2个品种系，9对引物能区分其中的1个品种系。对扩增结果采用Nei-Li相似性系数的计算方法，南果与南果红色变异系之间的相似系数为0.984，考密斯

8、及其色泽变异品种系之间的相似系数为0.912。表2变异品种系产生差异片段结果Table2Polymorphicfragmentbythevariantcultivars(strains) 引物 Primers 长度(bp) Length(bp) 南果 Nanguo 南果红色变异系 Red variant strain of Nanguo 考密斯 Doyenne du Comice 红考密斯 Red Doyenne du Comice 早红考密斯 Early red Doyenne du Comice 早红考密斯绿色变异系Green variant strain of Early red Doy

9、enne du Comice M-CAG/E-AAC 255 1 0 1 1 1 1 M-CAG/E-ACC 300 1 0 0 0 0 0 M-CAT/E-ACG 290 0 1 1 1 1 1 M-CAT/E-ACC 350 1 1 0 1 0 0 320 1 0 1 0 0 0 238 1 1 0 1 0 1 M-CTA/E-AAG 272 0 0 1 1 0 0 265 0 0 0 1 0 0 230 1 0 0 1 0 1 M-CTA/E-ACT 285 1 0 1 1 0 1 274 1 1 1 0 1 1 246 1 1 0 1 0 1 M-CTC/E-AGG 256 1 0 0

10、 1 0 1 em7/me3 300 1 0 0 0 0 0 em8/me7 201 0 1 0 0 0 0 em11/me5 700 0 0 0 0 1 1 296 0 0 0 1 0 0 270 1 1 0 0 1 0 242 0 1 1 1 1 1 2.4不同品种系的指纹图谱及系谱关系综合AFLP与SRAP标记的检测结果，获得4个品种系的特征谱带，南果梨在引物M-CAG/E-ACC300bp和em7/me3310bp图2处有特征带；红考密斯在引物M-CAT/E-AGG370bp和em11/me5296bp图1、2处有特征条带；早红考密斯在引物em8/me3240bp和em11/me322

11、0bp图2处有特征带；早红考密斯绿色变异品系在em8/me3220bp图2处有特征带。特征带是进行品种或类型鉴别的重要指标，依据以上特征指纹我们可以将其从供识材料中立即识别出来。此外，指纹图谱还揭示了供试材料间的差异谱带，如考密斯在引物M-CAT/E-ACA240bp条带处缺失，其它品种系均有该条带扩增图1；早红考密斯的绿色变异在引物em7/me3315bp条带处表现缺失，其它品种系有条带扩增。SRPA引物em11/me5可区分除红安久及其变异系以外的所有供试材料，可应用于品种系的分子鉴别。利用NTSYSpc2.02对8份供试材料的AFLP和SRPA谱带进行聚类分析，结果如图3。根据相似系数0

12、.8可将所有品种分为2个类群，属东方梨的南果梨及其变异聚为一类，而其他6个西洋梨及其变异类型聚为另一类群，说明了东方梨与西方梨具有较远的遗传关系。在西洋梨类群中，各变异类型与其相应的原始品种表现出较高的相似性。图3AFLP标记和SRAP标记结果聚类图品种18同表1所示Fig.3DendrogramofAFLPMarkandSRAPMarkCultiavr18:notedasTable13讨论3.1果树突变的鉴定方法可用于突变鉴定的主要方法有形态学观察、同工酶分析、染色体变异数量与结构的检测、孢粉学研究和分子标记技术。形态学观察主要适用于成龄的果树品种，鉴定的周期长，并且易受环境因素的影响，结果

13、可靠性差；染色体变异数量与结构的检测，受染色体制片技术和分辨率的限制，核型分析应用于芽变鉴定还有一定的难度，尤其是对于大多数具有小染色体和结构差异较小的果树来说无法到达鉴别的目的；孢粉学鉴定芽变需要结合电镜分析，制样方法同样受到影响，并且即使同一品种内花粉粒之间也存在个体差异，因此必须结合其它指标进行综合分析才能提高其可靠性；同功酶分析相对稳定和可靠，但由于受组织器官特异性和发育阶段特异性的影响，使得其在实际应用中也受到一定程度的限制。随着分子标记技术的出现与开展，使得果树品种系的鉴定直接在DNA分子水平上进行，这在很大程度上提高了突变鉴定的效率，因此应用越来越广泛。金勇丰等最早利用RAPD标

14、记分析桃品种布目早生;和其早熟芽变大观1号;基因组DNA多态性，筛选出1个引物可检测出两者间的多态性。Scott等第一次成功地采用AFLP技术鉴别了葡萄的体细胞变异，64对引物组合中有2对可产生特异片段,它们可以区分亲本与体细胞变异。LuisGoulo等曾用RAPD和AFLP标记对41个苹果的芽变品种进行了鉴定，并得到两种标记是相关的；CaiYL等利用RAPD鉴定了樱桃芽变，得到除红灯;之外其他品种的一条或更多的特征谱带；鲁风娟等将AFLP技术应用于梨芽变的鉴定，得到AFLP技术可以高效率的鉴定梨芽变。并取得了成功。但是，在通常情况下，由于体细胞的变异只涉及了基因组极其微小的局部，利用较少的标

15、记检测基因组相当小的范围，往往得不到所需的标记。例如，Tignon在苹果变异品种的鉴定中，使用6对AFLP引物组合就没能区别变异品种和其母本品种。本研究应用54对AFLP标记和20对SRAP标记成功鉴定出了南果以及考密斯的色泽变异种系，但是红安久及其绿色变异系却无法区分开，分析其原因可能是所使用的引物缺乏，而无法检测到变异位点，因此，更多引物的开发和利用对于突变体的鉴定是十分重要的。3.2不同分子标记的鉴别效率近20年来，分子标记技术开展较为迅速，数目类型繁多，应用于突变鉴定的标记先后有RFLP、RAPD、SSR、AFLP、SRAP等。RFLP由于涉及到分子杂交等试验条件的限制，其应用的范围并

16、不广泛。RAPD和AFLP标记在突变鉴定中应用较多，Monte-Corvo的研究说明RAPD标记和AFLP标记都适合于鉴定梨芽变，但是相比拟AFLP标记可检测到更高的多态性，结果更有重复性和可靠性。已有的多数研究说明，SSR标记难以应用于芽变品种的鉴别。Yamamoto等曾利用9对SSR引物对二十世纪及其芽变(金二十世纪、奥嗄金二十世纪)、巴梨及其芽变红巴梨进行分析，均无法区分原种及其芽变；曹玉芬等也曾利用12对SSR引物以鉴别鸭梨及其垂枝型芽变垂枝鸭梨和四倍体倍性芽变晋县大鸭梨、南果梨及其大果型芽变大南果，结果也是失败的。路娟曾利用SSR标记鉴定新高及其黄皮绿枝型芽变大果水晶，黄花及其大果型

17、芽变大果黄花，考密斯及其浓红芽变品种红考密斯，均无法区分原种及其芽变。SRAP标记是Li等创造的一种新的标记类型，目前在果树芽变鉴定中的应用还较少。张四普等筛选了600对SRAP引物组合，获得了红花石榴与白花变异枝中的1个差异条带。从本研究结果来看，AFLP和SRPA两种标记均适合于梨突变类型的鉴定，但从揭示的多态性来说，AFLP标记效率高于SRPA标记。这可能是因为AFLP标记在一次反响中可检测的位点数明显高于SRAP标记。可见，到目前为止AFLP标记仍不失为检测突变体的首选方案。4结论本研究利用AFLP标记和SRAP标记成功鉴定出了南果、考密斯的色泽变异品种系，并得到南果、红考密斯、早红考

18、密斯和早红考密斯绿色变异系的特征谱带；红安久及其绿色变异系没有被区分开。与SRAP标记相比，AFLP标记对芽变鉴定的效率更高。参考文献1 CAO Yu-fen, LIU Feng-zhi, GAO Yuan, JIANG Li-jie, WANG Kun, MA Zhi-yong, ZHANG Kai-chun. SSR analysis of genetic diversity of pear cultivars . Acta Horticulturae Sinica, 2007 , 34(2):305-310.2 Luis G, Luis C, Cristina M O, Jose M L

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