制药用水污染和控制剖析

1、第 页共29页第五章水系统中微生物的控制微生物对制药工艺用水系统的污染微生物污染，对制药工业中的工艺用水来说，既是一个极需严肃对待的严重问题，又是一个并不鲜见的问题。无论是要求最高的注射用水系统或是普通的纯化水系统，作为制药工艺用水，都应严格的将水系统中的微生物污染水平控制在药品生产工艺要求规格标准以下。尽管由于各个国家工业化发展的水平不一样，其制药工业的水平和要求也不尽相同。但中外所有关于水系统规范或文献都无一例外的，或多或少的都要求对工艺用水系统中的微生物进行检测和控制，以避免和减少微生物污染对制药工艺工程造成破坏。而对于工艺用水系统中的微生物控制大都围绕对污染菌源种类的分析判断，确定控制

2、方法。通常围绕对工艺用水的制备、贮寸单元和配水管道采用各种方法进行消毒灭菌，将工艺用水系统中的微生物数量控制在药平生产工艺所需的标准以内。水系统中的微生物污染主要来源于进料水。进料水的质量最低必需满足饮用水的质量要求。在饮用水中，大肠杆菌已经得到控制。进料水中有可能存在大量其他微生物，其类别主要是革兰氏阴性菌，这些微生物有可能不利于下一道水处理的净化工序。水系统微生物污染主要分为外源性污染和内源性污染两大类。微生物对制药工艺用水系统的污染种类较多，主要污染来源于以下几个方面：原水的污染在纯化水系通的原水中可以找到各种细菌，细菌的直径通常在0.5Pm5Mm之间。区分细菌种类的方法有正膜和负膜，它

3、以在干燥和清洗过程后保持干燥为基础。膜试验的结果要依靠细胞的结构，因此显示许多其它性质。多数水生的细菌是膜负性的，在纯化水系统中发现的细菌一般是负性的，因为正在细菌不能在低营养状态下存活。负性的细菌比正的对热更敏感，因此不能在高于60C的条件下增殖。然而，在系统中的膜负性的生物体不能完全被除掉，卫生处理和测试过程必须将其考虑在内。外源性微生物污染水系统中的微生物污染主要来源于进料水。进料水的质量最低必须满足饮用水的质量要求。在饮用水中，大肠杆菌已经得到控制。进料水中有可能存在大量其它微生物，其类别主要是革兰氏阴性菌，这些微生物有可能不利于下一道的水处理的净化工序。水系统的微生物污染主要分为外源

4、性污染和内源性污染两大类。外源性污染主要指来自水系统外部的原因，对系统内部造成的污染。水系统微生物污染的外部来源主要有以下一些方面：在贮罐上的排气口没有使用呼吸过滤器保护造成污染；使用呼吸过滤器内使用了质量不完善的空气滤芯，或者整个组装好的呼吸过滤有泄漏，不完整造成污染。水系统中有已经被污染的出水口，并且发生了水的倒流而产生的污染；贮罐的排气口阻塞，呼吸过滤器不起作用造成的污染；由于更换活性炭过滤器和离子交换器中的活性炭和去离子树脂时，细炭粒和树脂残片给水系统带来的外源性污染。因此，水系统的设计和维护应足够注意以把这些外源性污染减小到最低程度。内源性微生物污染水系统中各个设备单元的操作，可能是

5、系统中主要的微生物内源性污染源。存在于进料水中的微生物容易被吸附在活性炭床、离子交换树脂、过滤器膜和其它水处理单元的表面上，并逐渐形成生物膜。生物膜是某些种类的微生物生存于低营养环境下的一种适应性反应。生存于生物膜中的微生物受到生物膜的保护，许多化学消毒剂对生物膜毫无作用。如果其中某些微生物被冲洗脱落并送往水系统的其它区域时，在水系统的下游就可能形成微生物菌落群体。微生物也可能吸附于象细微的粒碳一样的悬浮固体粒子上，这些就成为水系统中下游处理设备和配水管道系统的污染源。另一个内源性微生物污染源是配水管道系统。微生物能在配水管道的内表面、阀门和其它区域内生成菌落群体。在这些地方，微生物大量繁殖，

6、形成生物膜，而这个生物膜就是一个水系统内部持久性的微生物污染源。因此，正是这些内源性污染源的存在，导致水系统在设计和制造工艺技术的长足的进步。目前，为克服水系统中内源性污染对制药工艺用水的影响，在水系统的设计和制造过程中，已广泛采用新的工艺技术，例如，在贮罐内顶部设置起在线清洗作用的喷淋球、注射用水系统循环水泵采用卫生级泵而且采用本身输送的介质进行密封、配水管道采用304L或316L不锈钢材料、管道的连接以轨道自动惰性气体保护焊接为主加上卫生卡箍连接为辅的连接体系、管道中使用的阀门越来越多的采用不锈钢隔膜阀或其它卫生级的球阀和蝶阀、系统设置热交换器严格控制流动与贮存的水温、系统中大量设置取样点

7、方便系统验证和日常监控等等。细菌性热原污染药剂学上的“热原”通常是指细菌产生的热原，是指那些可能致热的微生物的代谢产物。大多数细菌和许多霉菌都能够产生热原。其中，致热能力最强的是革兰氏阴性杆菌的产物。微生物代谢产物中的内毒素是造成热原反应的最主要因素。一般输入含有热原的注射液以后，在1和3小时处有两次体温上升的高峰，常称为“双热高峰”。通常解释为：第一个高峰是内毒素直接作用于下丘脑体温中枢。第二个高峰是由于外来性致热物质（如细菌或内毒素）被多核的白细胞吞噬或再从白细胞中分离出来的致热物质。这个物质称为白细胞热原，其毒性比原有内毒素高出上百倍，从而使体温有时上升到40C。在药典中有明确的细菌要求

8、的是细菌内毒素。美国药典对注射用水的内毒素限制是0.25EU/ml。即使是在水的存贮和配送过程中很快被破坏的细菌也会释放出内毒素。所以在进入配水系统以前采取除去细菌的处理措施是必要的，它比在配水系统中依靠保护措施（例如加热）来除去细菌会更好。无论是外源性污染或是内源性污染最终都可能是导致热原污染。细菌性热原主要是革兰氏阴性杆菌产生的内毒素，存在于细菌细胞外膜，当菌体细胞裂解时释放出来。它是细胞膜科的组分衍化而成的磷脂多糖体，磷脂多糖体再与蛋白质结合形成高分子复合物称为内毒素。复合物中的磷脂多糖体是热原的活性中心，致热作用最强。磷脂多糖体是由多糖（葡萄糖、半乳糖、庚糖、H-乙酰葡萄糖胺等组成）通

9、过KDO（2-Keto-3-deoxyoctonate）键而与磷脂A（LipidA）结合组成一个单位结构，由许多这样的单位结构组成长链的巨大分子。磷脂多糖体的化学组成因菌种不同而异，从大肠杆菌分离出来的磷脂多糖体中由68%69%的糖，12%13%的类脂化合物，7%的有机鳞和其它一些成分。磷脂多糖体的分子量约为5*104-5，也有认为是7*105-7，其分子量越大致热作用也越大。细菌性热原有如下理化性质：耐热性强热原在60C加热1小时不受影响，100C也不热分解。120C加热4小时破坏98%。180C200C干热2小时以上或250C，45分钟可被彻底破坏。各种革兰氏阴性菌分离出来的热原耐热性较强

10、，这种热原在中性介质中，即使加热到150C经数小时也不会裂解。青霉菌属的热原耐热性亦强，通常的121C,30分钟的灭菌程序处理对它影响，必须使温度达到180C，4小时、250C,45分钟或650C,1分钟才能被完全破坏。相反，革兰氏阴性菌的代谢产物中的毒素也能产生致热反应，但致热作用较弱，要比内毒素低8倍左右。内毒素主要由蛋白质组成，故耐热性差。过滤性热原的体积大小多数约在0.1pm50pm之间，可通过除菌过滤器进入滤液中,但能被活性炭、硅藻土滤器等吸附。不挥发性：热原本身不具有挥发性，但能在蒸馏时被未气化的水滴机械地带入蒸馏水中，故蒸馏水机均没有隔沫汽液分离装置。注射用水中含有热原是注射剂热

11、原污染的主要原因。水系统中革兰氏阴性菌可以很平稳地形成生物膜，这个膜就成为内毒素的发源地。内毒素同活着的微生物体或者死掉的微生物体的碎片有关，内毒素也可以以分子状态游离存在。游离的内毒素分子可能来自于细胞表面或者来自于水系统中形成菌落的生物膜，或者是由进料水带入水系统中。可以通过控制微生物的进入系统和控制微生物的繁殖，将内毒素降至最低。水处理系统内各操作单元进行常规操作以除去微生物，以及对系统进行消毒也能够达到去除微生物的目的。其它的控制方法包括在管道内或者在水中使用点处使用超滤器或者带电介质过滤器。去除热原有两种最成熟而有效的方法收载于美国药典：蒸馏及反渗透。超滤法也可去热原，超滤属机械过滤

12、，尚不是美国药典正式收载的去热原方法。制备注射用水所用的蒸馏设备有多种，其构造也各异。有单蒸馏水器与重蒸馏水器。国内过去普遍使用塔式重蒸馏水器。国外使用比较节约蒸汽和冷却水的自动控制的气压式蒸馏水器和多效式蒸馏水器，这种设备制备注射用水时产量大而且经济，已在国内逐步普及。使用蒸馏法制备注射用水，是较优良的进一步纯化水的方法，可以用来除去水中的微细物质（大于1pm的所有不挥发性物质和大部分0.09m1m的可溶性小分子无机盐类）。原料水经过蒸馏后，除去其中的不挥发性有机、无机物质包括悬浮体、胶体、细菌、病毒、热原等杂质。由于蒸馏水器的结构、性能、金属材料、操作方法以及水源等因素，必然会影响蒸馏水的

13、最终质量。传统的抑阻水滴雾沫的填料、挡板组甩隔沫装置和逸出挥发性气体排出的放气口装置往往达不到理想的结果。多效蒸馏水机设置有特殊的去热原装置，通常是超长管板式汽液旋风分离装置。一般能达到使原水中的细菌内毒素下降2.53个对数单位的效果。应当注意，这种热原分离并不是绝对的，应对进入多效蒸馏水机的原水的质量加以控制。注射用水是可能用于配制药品溶液的，尽管美国药典并没有特别的微生物限制的参考，注射用水通常不含微生物体，因为有些微生物成分可能出现在试验过程中，所以通常要规定一个10CFU/mL的反应限制。注射用水系统中的细菌含量是引起关注的原因并应该进行彻底调查。尽管在注射用水系统中的细菌成分会导致产

14、生内毒素，但测试试验时通过一个内毒素限制而不是细菌限制的情况也是可能出现的，所以在测试中这两个试验都应该进行，并定这两个试验各自的限度。应注意，内毒素水平不能直接与细菌量联系起来判断。过滤去除工艺用水中的热原物质热原的化学特性是一些物质在注射剂使用过程中会引起人体的发烧反应，而且来源不明，只是知道大概是糖类或蛋白质物质引起人体发烧、淋巴细胞的移动、补体的激发和组胺的释放。通常，引起热原反应的主要物质是革兰氏阴性细菌细胞外壁的脂多糖，一般又称为内毒素。就微生物而言，热原性物质，是指革兰氏阴性微生物。非热原性物质，则指革兰氏阳性微生物。通常，除热原的应用方法主要集中在：水系统或其使用点除热原，水针

15、剂、大输液、冻干粉针剂等内毒素阳性产品的除热原，药物分包装前作预防性除热原处理。除热原有如下一些方法：热力法用加热的方法，热分解热原物质。例如在制药工艺过程中，经常使用250C以上的高温，保持一定的时间分解材料携带的热原物质。氧化法，使用热酸或碱性水解氧化的方式，化学降解热原物质。注意，使用化学降解不可以使用还原剂如卤化物、环氧乙烷等；水解法：蒸发法，例如溶媒的蒸发，蒸发中气相会带走其中的热原的成分。但是，在溶媒蒸发的过程中，会因为相的改变影响一些产品的质量；吸附法；微孔过滤法；反渗透法；超滤法；需要注意的是，传统的灭菌方法如煮沸、高压蒸煮、常规过滤方法对热原几乎不起任何作用，不是去除不了热原

16、，就是能够去除热原，但没有实际的工业使用价值。例如：使用高压蒸汽灭菌汽灭菌设备除热原，在126C条件下，需要7个小时,在145C条件下也至少需要30分钟以上，基本上不基本工业生产使用价值。下面着重介绍几种制药工艺用水系统种常用的去除热原物质的方法。反渗透法热原的去除可以依靠控制分子量的大小来完成，反渗透去除热原即利用了这一原理。反渗透膜的孔径大小一般在100分子量到200分子量。通常，使用反渗透法用于去除水中的热原比较合适，但由于反渗透膜的分子量较小，产品与热原可能会同时被膜挡住。并且，对反渗透膜用碱清洗的能力有限，其过滤速度也比微孔过滤的超滤慢。含有热原的药液图5-1反渗透除热原示意图微孔滤

17、膜过滤微孔滤膜过滤也可以用作去除热原的手段。主要原理是利用微孔滤膜比较均一的开孔直径来拦截直径比较均匀的那一部分热原物质。但是，由于热原的组成呈多样化，其中形成小泡状的热原会通过0.22mm微孔滤膜，形成微团状的热原还可以通过0.025m滤膜，而以单元形式存在热原可以通过几乎所有的微孔滤膜。因此,利用微孔滤膜以截留的方式去除热原，在使用上具有明显的局限性。图5-2微孔过滤示意图超滤法超滤除热原，主要根据热原分子量的大小，选择超滤膜的不同截留分子量孔径来满足去除热原的需要。即把溶液中不同大小的分子用压力驱使其通过很薄的膜进行分离。通常，小泡状的热原能够通过0.22mm的滤膜孔，使用普通的0.22

18、mm微孔薄膜的除菌过滤器不能对其截留，而小泡状的热原需要在0.025m的孔径下才能被拦截。微团状的热原可以通过0.025m的滤膜孔，在1百万分子量的孔径下被截留。单元状的热原物质甚至能够通过1百万分子的滤膜孔，需要在1万分子量的膜孔截因此，使用于去除热原的超滤膜孔径定性选择1万分子量的膜，这样，小泡状、微团状、单元状的热呀物质都会被滤膜拦截住，而此时产品仍可以顺利通过滤膜。这个过滤器的过程不会产生相变，也没有任何添加物质进入产品溶液中。并且超滤膜也比较容易清洗和利用其它方法去除膜上残留的热原物质。总之，利用超滤的方法，热原物质可以通过分子排除的方式过滤去除。除非在某种特殊或极端的情况下，可能出

19、现以外，例如洗涤剂和螯合剂。一般十万分子量的超滤膜可以定量地去除热原物质。而使用一万分子量的超滤膜，可以在所有的情况下，定量地去除热原物质。超滤除热原的截留情况可由下图所示：含有热原的药液图5-3超滤除热原的示意图吸附法除热原使用吸附的方法液可以有效的去除热原，采用吸附的方法除热原常用的材料有石棉、活性炭、硫酸钡、阴离子交换树脂等。石棉，对水、糖溶液等比较有效，但不能使用在氨基酸溶液的热原去除。同时，由于石棉的污染，目前不允许石棉材料制造的过滤器使用在药品制造的工艺过程中。活性炭吸附是一种工艺工程常用的去除热原的方法，活性炭吸附通常要与0.22“m的薄膜过滤器联合使用，多用在各类药液的热原去除

20、。但是，活性炭的使用量要比较大才有效，而且从效果上看，对不同的药液，效果差异很大。并且，当活性炭的用量较大时，对药液的有效成分损失也较大。而使用阴离子交换树脂去除热原时，对药液中内毒素较小含量时较适用。至于硫酸钡去除热原的效果，就不一定可靠了。利用吸附的方式去除热原，还面临一些其他的困难。由于吸附的特点是，对任何液体的溶质都是非选择性的，因此会把产品的有效成分给吸附掉一部分，这对一些价值较高，含量本来就较低的制品是难以接受的。同时，对每批药液之间因热原含量不同，会导致在同等吸附条件下去除热原的效果也不同，结果是吸附效果不稳定。另外，在吸附过程中，由于热原并没有和药液分格开来，有可能会因为条件的

21、改变使热原再度释放出来。而且如果吸附工艺过程控制不够好的话，依附在吸附剂上的细菌的生长，还可能会增加热原的含有量。还有，去除热原的过程中，液体流动的条件对去除热原的效率也有很大的影响。各种方式过滤后去除热原的结果在1，000ng/ml细菌内毒素液体中，使用各种方式过滤后的结果如下：表5-1不同方式过滤后内毒素浓度样品成分滤液中内毒素的浓度EGWPVSWPPSVPPTHKPTGC0.22m0.025m1，000K100K10，000水1,0000.10.10.10.1盐水1,0000.10.10.10.1氯化镁0.10.10.1二乙胺四乙酸1，0000.10.1脱氢胆酸钠1，000100.1脱氢

22、胆酸钠+EDTA1，0001，0000.15.2工艺用水系统中微生物的鉴别上海宝钜实业有限公司技术资料第 页共29页在制药工艺用水系统的原水中可以找到各种细菌，大多数水生的细菌是膜负性的，在纯化水系统中发现的细菌一般也是负性的，因为正性的细菌不能在低营养状态下存活。另外，负性的细菌比正性的对热更加敏感，因此不能在高于60C的条件下增殖。然而，在系统中的膜负性生物体不可能完全被除掉，系统的消毒处理和测试过程都必须将其考虑的内。典型的细菌通常在0.5m到5m之间，通常用来检验除菌膜孔径大小的缺陷假单胞菌(Pseudomonasdiminuta)具有最小的细菌尺寸约为0.3m。由于，多数检测水中微生

23、物数量的技术和方法都需要有2到3天时间，不马上检测给具体数值。因此，美国药典对纯水的规定不包括微生物限制。5.2.1微生物的培养经典的微生物培养法用于水系统微生物检测的经典的培养方法包括注皿培养法、平板涂布法、膜过滤法以及最大可能性数目测试法，但不只限于这些方法。这些方法一般来说操作方便，成本低廉，而且能处理大量样品。尤其是增大样品处理量，可以提高方法的灵敏度，这种检测思想特别适用于薄膜过滤法。结合培养基的类型以及培养温度的时间可进一步定义培养方法，但还应该根据特定的水系统的监控要求，以及使用的培养基恢复可能对产品或工艺过程有危害影响的微生物的生长能力来选择怎样将培养基及培养温度于时间结合在一

24、起。在传统的微生物学分析中，有两种基本类型的培养基：一种是高营养型的，另一种是低营养型的。高营养型培养基一般用于异养型细菌的分离和计数，低营养型培养基用于分离缓慢生长细菌和接触过消毒剂而受伤的细菌。一般应该用低营养型培养基与高营养型培养基进行对照，特别是在水系统的验证试验中，用这种方法来决定是否存在额外类型和数量的细菌，并以此来评估可能对最终产品产生的影响。此外，对这些慢性生长细菌或受伤害所实施的消毒，以及系统的控制效能也可以据此作除评估。培养温度和培养时间也是微生物学检测方法中的一个重要方面。经典的检测方法学采用高营养型培养基，培养温度通常在30C35C，培养时间48小时72小时。特殊的培养

25、方法在某些水系统中，采用低温培养（20C25C）,并且延长培养时间（5天7天）。这种培养方法同经典方法相比，能够产生出更多数目的细菌。在对水系统验证时，应决定是否采用较低温度的培养方法，或者采用较长培养时间法来对水系统进行监控。当测试结果超出水系统的警戒水平或标准水平时，就应该决定采用较长的培养时间法以便获悉必要的信息，并了解应该采取何种纠正措施。应该把由延长培养时间赢得的有利条件，即受伤微生物、慢增长微生物以及需要复杂营养的微生物能够恢复生长，及时地调查和采取纠正措施以及这些微生物损害产品和工艺的能力进行对比，权衡得失。5.2.2微生物的检测分析方法仪器方法常用的仪器检测方法有：显微镜直接计

26、数技术、辐射计方法、阻抗计方法以及基于生物化学上的方法学，这些方法各有优缺点。仪器法的优点是其准确性和精确性。一般使用仪器方法能够在较短时间内获得检测结果，这有利于对系统进行及时控制，是其优点。但是，由于这种方法要求人工对样品进行精细处理或者由于仪器的局限性，它又有其样品处理量较小的缺点。此外，仪器法检测对微生物是破坏性的，这就妨碍了为鉴别微生物的性质而进行的进一步的微生物分析。培养法一般来说，某种微生物的特性鉴别是水系统的监控要素之一。因此，传统上优先使用培养法，因为它同仪器法相比有两个优点：理想的检测特点，操作方便：理想的事后检测能力，能处理大量的样品。水系统测试推荐的方法在水系统的测试或

27、验证试验中，下述方法适合于用以建立制药工艺配料水的常规微生物学监控中观测到的菌团(CFU)数目的动态情况，应该注意到关于培养基的类型、培养时间和温度及其组合有可能或者肯定会生成更大数量的菌团。如其它方法所要求的一样，延长微生物的培养时间，会产生更多数目的菌团，但是，假如延长培养时间会带来许多不利条件，那么这样做就毫无意义。用以监控制药用水系统的推荐方法如下：饮用水：注皿培养法最小样品量1.0ml琼脂平面培养基培养时间42小时72小时，温度30C35C；洁净水：注皿培养法最小样品量1.0ml琼脂平面培养基培养时间48小时72小时，温度30C35C；注射用水：膜过滤法最小样品量1.0ml琼脂平面培

28、养基培养时间48小时72小时，温度30C35C；微生物的鉴别如果某种特定的水生微生物，对某一种产品有害或者对某种制药工艺过程有影响，而在此工艺过程种要用到水，那么鉴别从水中恢复生长的微生物就非常重要了。当鉴别一个产品或一个工艺过程中的微生物污染源时，微生物这些方面的信息是非常有用的。通常，只有一些有限的微生物能够不断从水系统中恢复生长出来。一个有经验的微生物学工作者经过反复多此对某种微生物性质的认识，就可以根据仅有的一些特征，比如菌落形态和着色特征等熟练地对微生物进行快速的鉴别。工艺用水系统水质控制标准与警戒水平微生物控制是在工艺用水系统的指定取样点，通过测试水样进行的。对于必须控制热源的系统

29、（如WFI）,必须进行细菌内毒素LAL检查。细菌培养的结果出来几天前，需要处理（如过滤），孵化和记录。细菌生长的确定需要较长的时间。所以需要在线连续的记录系统，从而在试验的过程中建立起结果和系统操作资料的关系（如卫生处理记录，冲洗记录，系统操作记录数据，试验技术的确认等等）。系统水质警戒水平和标准水平药典关于纯化水和注射用水都没有给出确定的微生物限度。这是在技术上有目的地省去的。因为目前大部分检测微生物的技术需要至少48小时才能获得确切结果，到那时，通常样品源已经使用在生产工程中了。因此，美国药典对纯化水的规定不包括微生物限制。必须建立警戒水平和纠偏限度。美国药典也讨论了符合最终使用的纯化水质

30、量的要求。在药典中建议了一个100CFU/mL的反应水平。在FDA关于高纯水系统的检验指导中也规定了高手100CFU/mL的纠偏限度是不能接受的。因为实际的微生物含量要依靠检测方法和技术，关于灵敏的反应水平的规定应该在明确了方法的基础上进行，包括时间、温度和媒介。比微生物总含量更重要的是持续的有效管理过程，这个管理过程会在出现问题前表现出可能出问题的趋势。当然，确定每一种成分的含量及总数量也是很重要的。工艺用水系统中，警戒的水平要根据统计数字设置，来减少高于系统正常操作范围的结果，并用来在达到反应限制前检查和解决问题的目的。水的质量不符合规格标准，就会使整批有关产品报废，这并不是设立警戒水平或

31、标准水平的目的，也不是设立警戒水平能够解决的问题。而应当建立一个有关制药工艺用水的量化的微生物学准则，这个准则将会确定当检测结果超出限度范围时所应采取的措施规程。应当对水系统进行微生物学监控，以确保系统在设计规格条件范围内运行，并能生产出质量合格的产品水。监控的数据可以和所建立的工艺参数以及产品规格标准进行对比。精心地研究工艺参数和产品的规格标准之间的关系，在此基础上建立警戒水平和标准水平。警戒水平和标准水平是不同的，也不同于工艺参数和产品规格标准。因为它们只是用于系统监控，而不是用于判断合格或不合格，因而其数值较工艺参数和产品规格大。水质警戒水平是指水的质量水平或范围，当警戒水平被突破时，表

32、明工艺运行已经偏离了正常运行条件。警戒水平仅意味着是一个警戒，而没有必要求实施纠正措施。水质标准水平是指水的质量水平或范围，当它被超出时，表明工艺运行偏离了正常运行条件。超出标准水平时，应当立即采取纠正性措施，使得工艺运行回复到正常运行条件下。从对技术和产品的综合考虑，警戒水平和标准水平应建立在工艺和产品规格标准的范围之内。因此，超出警戒水平和标准水平并不意味着整个工艺过程已危及产品质量。在设立警戒水平和标准水平时，在技术上还应考虑到对确保水处理设备能够取得所要求的水的纯度水平的设备设计规格标准进行详细确认。此外，应定期采集水样品进行分析，分析数据应能够反映出正常的质量动态变化。使用这些数据还

33、可以建立水系统历史运行水平和统计学水平的档案。用这种方法建立起来的水平是不受产品规格标准支配的。因此，警戒水平和标准水平应当充分体现出产品质量各种要求，以及水系统有效控制各个水处理工序的处理能力。这两个监控水平一般是建立在对工艺数据的考虑，以及对产品化学和微生物污染的敏感性评估的基础上的。产品敏感性的评估还应包括对产品的防腐效能、产品在水中的活性情况、pH等等项目的评估。两个监控水平确定的原则是，当监控指标被超出时，并不会危及产品质量安全，但需加于调控。应不断地对监控过程得到的数据进行分析，以确保工艺过程在允许限度内连续地运行，对数据动态的分析结果通常用来评估水处理工艺的运行状况，据此信息可以

34、预计水处理工艺相对于所设定的工艺操作参数的偏离程度，并且还说明何时有必要对系统实行适当预防性维护保养操作。工艺用水系统运行的内控标准应该充分地认识到，任何制药用水系统所建立的微生物警戒水平和标准水平，都必需跟所选用的监控方法和与其匹配的标准水平联系在一起的。采用上述推荐的检测方法，一般认为合适的内控标准水平应分别为：饮用水应小于500CFU/ml;纯化水应小于100CFU/ml;注射用应小于10CFU/100ml。需注意，上述的标准水平并不适用于所有的适用配料用水的场合。例如：革兰氏阴性菌并没有被排除在配料用水之外，药典中也没有规定饮用水中不允许有革兰氏阴性菌。究其原因是对于水环境来说，微生物

35、无处不在，而且要清除微生物就要求进行灭菌处理，。而灭菌在许多生产方案中是不合适的或者是不可行的。并且，许多场合微生物也并不能够存活，例如在某些局部用药和某些口服剂性当中。工艺用水系统的消毒灭菌通常，在制药工艺用水系统中适用的消毒灭菌方法，主要分为两大类。一类是物理消毒方法，包括常用的热消毒方法（巴氏消毒、纯蒸汽灭菌等）和紫外线辐射消毒，这类物理消毒方法的最大优点是在消毒过程及消毒处理以后，不会在工艺用水系统中产生不能够接受的，影响水质的消毒残留物。因此，物理消毒方法是工艺用水消毒的首选方法。工艺用水消毒的另一类方法是化学消毒法。使用化学方法消毒，常用氧化的方法的原理。氧化消毒使用的材料种类很多

36、，常见的氧化剂有氯类和氧类，氯类氧化剂有液氯、次氯酸钠、次氯酸钙、二氧化氯等。氧类氧化剂有空气中的氧、臭氧、过氧化亲氢和高锰酸钾等。由于这些化合物的半衰期较短，特别是臭氧，在消毒过程中应当不断补充这类消毒剂。过氧化氢和臭氧迅速降解成水和氧气。在紫外光下，过氧乙酸降解成乙酸。氯气（CL2）通入水中后，由于水解作用而生成盐酸（HCI）和次氯酸（HOCI）,次氯酸是中性的分子，它能很快扩散到带负电荷的细菌表面，并透过细胞膜进入细胞核。次氯酸中的氯原子(CI),能氧化破坏细菌细胞中的酶，从而导致细菌死亡。应当注意，由于细菌带有负电荷，水的pH对消毒效果很有影响，pH高时，次氯酸形成了较多的OCT负离子

37、，它们与细菌的负电荷互相排斥，因此会降低其消毒能力。卤化物是有效的消毒剂，但难于从系统中清洗掉，况且只有浓度很高时，如达到百万分之三百，才能对生物膜发生作用，过高浓度的消毒剂又往往对设备产生腐蚀，必须权衡二者的利弊。当原水中存在工业有机污染物时，氯化时会形成可能又致癌性的三卤甲烷、四氯乙烯等脂肪族化合物，以及氯苯、二氯苯等，因此氯的应用在工艺用水系统的消毒应用中，应该受到一定的限制。热消毒微生物的代谢作用，包括化学和物理的反应，深受温度的影响，在一定范围内提高温度可以加速微生物的呼吸作用。温度在微生物的活动中起着非常重要的作用。阻止工艺用水系统内细菌生长的最有效、最可靠的办法就是系统在高于细菌

38、生存的温度下运行操作。一般情况下，微生物生长的温度范围大约为-5c80C，就某一种微生物而言，其适合生长的温度范围通常较窄，这个最适合微生物生长的温度叫做某种微生物生长的最适合温度，在这个温度范围内，该种微生物生长最快。微生物生长的最高温度是指在最适合温度以上，微生物停止生长的温度。微生物生长的最低温度是指在最适合温度以下，微生物停止生长的温度。在最低温度和最适合温度之间，微生物生长的速度随温度的升高增加。在最适合温度和最高温度之间，微生物生长的速度随温度的升高增加。在最适合温度和最高温度之间，微生物生长的速度随温度的升高而降低。表5-2中列处了部分细菌在不同温度条件下的生长情况。表5-2部分

39、细菌和真菌在不同温度条件下的生长情况微生物温度范围最低最适合最高无色杆菌(Achromobacterichthyodermis)-22530嗜热防线菌(Actinomycesichihyodermis)285065根癌病土壤杆菌(Agrobacieriumtumefaciense)0252837枯草芽抱杆菌(B.thermophilus)15303755嗜热糖化芽抱杆菌(Bacillussubtilis)526575破伤风俊状芽抱杆菌(Clonridiumtetani)14373850白喉棒状杆菌(Corynebacteriumdiphtheriae)15343640大肠杆菌(Escheric

40、hiacoli)10303743肺炎克氏杆菌(Klebsierllapneumoniae)123740嗜热乳杆菌(L.thermophilus)30506365金黄色化浓小球菌(Mierococcuspyrogenesv.Aureus)153740结核分枝杆菌(Mycobacteriustuberrhoeae)303742淋病奈氏球菌(Neisserisgonorrhoeae)53755铜绿色假单抱菌(Pseudomonasaeruginosa)03742嗜热链霉菌(Streptomycesthermophilus)20404553黑曲霉(A.niger)7303947灰绿葡萄抱霉(Botry

41、tisnidulans)0152535尖镰抱霉(Fusariumoxysporium)4153240苹果青霉(Penicilliumexpansum)0252730酵母菌(Saccharomycessp.)0.5253040普通变形杆菌(Proteusvulgaris)103743通常，工艺以上系统可以定期使用纯蒸汽消毒，使管道系统重新回到系统微生物控制指标优良状态下，如果工艺用水系统内部的水始终保持在热处理环境下，例如80C，可以减少对管道系统定期进行卫生处理的频率。微生物对热的耐受能力，因其细胞本质及其环境条件不同而有所区别。工艺用水管道系统热处理的温度和时间条件，可以根据大多数细菌的耐热

42、情况适当地确定。表5-3为一些常见细菌的致死温度及其时间。表5-3常见细菌的致死温度与时间细菌种类致死温度及时间伤寒沙门氏杆菌(Salmonellatyphi)58C30min白喉棒状杆菌(Corynebacteriumdiphtheriae)50C10min嗜热乳杆菌(Lactobacillusthermophilus)71C30min普通变形杆菌(Proteusvulgaris)55C60min大肠杆菌(Escherichiacoli)60C10min肺炎球菌(Pneumonococcuspneumoniae56C57min维氏硝化杆菌(Nitrobacterwinogradskyi)50

43、C5min粘质赛氏杆菌(Serratiamarcescens)55C60min在80C热处理条件下运行的工艺用水系统，有经验数据记录显示微生物生长受到良好的控制。低于80C的温度的热处理的实际作用必须根据实例的试验数据加以证明。需要注意上表列出的这个温度范围并不能去除工艺用水系统中的细菌内毒素。细菌内毒素的去除，必须通过将工艺用水处理系统设计成为具有去除热原的能力。巴氏消毒巴氏消毒主要利用高温处理来杀死微生物。高温杀死微生物的能力极强，高温可以凝固微生物细胞内部的一切蛋白质，钝化其酶系统，造成细菌细胞的死亡。经典的巴氏消毒主要使用在食品工业中对牛奶进行消毒处理，用以杀灭牛奶中的结核菌，同时还不

44、会破坏牛奶中的新鲜维生素和蛋白质，使牛奶成为安全的营养品。采用罢职消毒牛奶的工艺条件是，先将牛奶加热到80C，停留一定时间，进行消毒，消毒后再冷却至常温，再出消毒器成为产品。为了节省能源，一般采用多效巴氏消毒器消毒牛奶。在多效消毒器中，第一效是将冷牛奶与热牛奶进行热交换器；第二效是将加热过的冷牛奶与蒸汽交换冷牛奶加热至80C并停留一般时间，完成对牛奶的消毒；第三效是将一效与冷牛奶交换过的热牛奶用水冷却至常温出消毒器即成牛奶成品。对水系统的细菌控制采用巴氏西欧度的方法也可行，水中存在着杂菌，由于杂菌再热水中不易生存，细菌不耐热。一般消灭这些杂菌采用静止水消毒时，消毒水水温要加热到95C100C这

45、样才能达到最佳效果。当用加热器、膨胀水箱、水泵、80C热水的消毒流程时，由于水的高速流动，不断冲刷和加热管道与设备中的介质，使管道与设备介质中的细菌无法藏身，同时受热而亡，这样用80C的热水，是能达到灭菌的目的，需要重视的是消毒操作和消毒处理时间。纯化水系统中的活性炭过滤器和软化器是有机物集中的地方，容易长菌。巴氏消毒主要解决碳活性碳的清理、消毒工作。纯化水系统中的活性碳在工作一段时间后，在活性碳的内表面吸附堆积了不少有机、无机盐和氯气等有害物质。特别氏碳滤中的活性碳氏细菌的滋生地，这些细菌在通过后续处理工序中的反渗透膜时，又不能被完全处理掉，这是对活性碳定期消毒处理的主要原因。在过去传统的操

46、作中，只是对碳滤惊醒正冲和反冲，正冲和反冲只能冲掉活性碳间的絮凝物，无法清理活性碳内表面的吸附堆积物，用80C3C的热水来处理活性碳，一方面可以将活性碳内表面吸附的堆积物冲刷出来，另一方面可以使活性碳内表面的细菌生长和繁衍，在热处理条件下受到抑制，而自行死亡。这对充分发挥活性碳的作用，延长活性碳的使用寿命，减少水系统的细菌量，产生不可估量的影响。通常可采用巴氏消毒法进行消毒处理，即用80C的热水循环1小时2小时。结束时反洗，一则起再生作用，二则消毒，这种方法行之有效。纯化水系统中的另一可以采用巴氏消毒处为纯化水的使用回路。图5-4巴氏消毒系统原理图纯蒸汽消毒纯蒸汽灭菌其实就是采用湿热靡然军的原

47、理和方法，对主要工艺用水系统进行灭菌处理。利用高压纯蒸汽这种热力学灭菌手段，杀灭工艺用水系统中的设备（贮罐、泵、过滤器等）内部和管道内壁可能存在的细菌。纯蒸汽灭菌系湿热灭菌，其灭菌能力很强，极其有效，且在整个灭菌的过程中，没有任何影响水质的附加物或残留物。纯蒸汽灭菌是热力学灭菌中最有效及用途最广的方法。除工艺用水系统的灭菌以外，整个药品生产工艺过程中，药品、药品的溶液、玻璃器械、培养基、无菌衣、敷料以及其他遇高温与湿热不发生变化或损坏的物质，均可采用纯蒸汽进行灭菌。纯蒸汽灭菌的原理如前所述，纯蒸汽灭绝即是湿热灭菌。湿热灭菌是指物质在灭菌器内（在主要工艺用水系统灭菌中为设备与管道零件等）利用高压

48、纯蒸汽与其他热力学灭菌手段杀灭细菌，高压纯蒸汽的比热大、穿透力极强、很容易使蛋白质变行、灭菌能力很强，是热力学灭菌中最为有效及适用性最广的方法。在自然界，有机物生命的生存繁殖的理想范围是-5C80C之间，除了某些耐热的芽孢以外，当温度高于这个范围，生物体通常会死亡。湿热灭菌即是利用微生物的这一特性，使用处于压力下的灭菌蒸汽作为灭菌剂，使微生物细胞丧失繁殖能力，导致微生物死亡。从微生物死亡的机理上讲，微生物的死亡可追溯到细胞中主要蛋白质及核酸的变性。这种变性是分子中氢键分裂所致，当氢键断裂时，结构被破坏，分子从而丧失其功能。但应注意，这种变性可以是逆转的，也可能是不可逆转的。如果氢键破裂的临界数

49、量未能达到，分子又可能回到原有的形式。与湿热灭菌有关的常数D值D值即微生物的耐热参数，系指一定温度下，将微生物杀灭90%（即使之下降一个对数单位）所需的时间。D值越大，说明该微生物的耐热性越强。不同的微生物在不同环境条件下具有各不相同的D值。Z值Z值即灭菌温度系数，系指使某一种微生物的D值下降一个对数单位，灭菌温度应升高度数，通常取10C。Fr值Fr值即TC灭菌时间，为灭菌程序所赋予持灭菌品在TC下的灭菌时间，以分表示，由于D值是随温度的变化而变化，所以要在不同湿度下达到相同的灭菌效果,Fr值将会随D值的变化而变化。灭菌温度高时，Fr值变小，灭菌温度低时，所需Fr值就大。F0值F0值即标准灭菌

50、时间，系灭菌过程赋予待灭菌物品在121C下的等效灭菌时间,即为T=121C、Z=10时的F0值，121C为标准状态，F0值即为标准灭菌时间，以分表示。灭菌率LL值指在某间温度下灭菌一分钟所相应的标准灭菌时间的分钟数，即F0和Fr的比值（L=F0/Fr）。当Z=10C时，不同温度下的L值是不同的（见表1）。不同Z值下的灭菌率均可查得（见表2）。无菌保证值（SAL）无菌保证值SAL（SterilityAssuranceLevel）为灭菌产品经灭菌后微生物残存机率的负对数值，表示物品被灭菌后的无菌状态。国际上把该值定为6作为最低限度的无菌保证要求，即灭菌后微生物污染的概率不得大于百万分之一。纯蒸汽灭

51、菌条件根据纯蒸汽发生器的能力和工艺用水系统的复杂程度，可选择如下条件进行灭菌：115.5C30分钟121.5C20分钟一个灭菌程度的总的标准灭菌时间F。，应包括及冷却过程的热效应。它可以用灭菌率对时间求积分的方法计算而得。式中：F0-灭菌程序的总的标准灭菌时间；T-灭菌时间t时的产品温度；t1-12-灭菌时间；对上述灭菌程序其标准灭菌时间F0不低于8,并经生物指示剂验证后，即可认为符合要求。（3）工艺用水系统纯蒸汽灭菌方法工艺用水管道进行灭菌时，纯蒸汽压力为0.2Mpa;当管道内温度升至121C时开始计时，灭菌35分钟。灭菌指示带应变色，否则须重新灭菌；灭菌后如工艺用水系统若不立即使用，应对系

52、统充氮保护；贮罐等容器设备，纯蒸汽灭菌前应进行清洗，灭菌后若过夜后使用，在使用前应用注射用水再次淋洗。臭氧消毒要在纯水系统中完全避免微生物污染是不可能的，使用臭氧对水进行消毒处理和在用水点前采用紫外辐射来减少臭氧残留，是制药工艺用水系统消毒的常用方法之一。臭氧消毒非常适合纯化水管道，只有低浓度的臭氧才适合于对系统进行卫生处理，并且不产生任何需要禁止出现在水系统中的副产品，或在臭氧分解成氧后留下任何残留物。即用臭氧灭菌不产生任何禁止的副产品或残余物。在无可氧化物质时臭氧会分解成氧，一旦水中有可氧化物质，就会形成二氧化碳。这些物质与水的质量没有重要联系。（1）臭氧的化学性质臭氧（O3）是氧的同素异

53、形体，它是一种具有特殊气味的淡紫色气体。其密度是氧气的1.5倍，在水中的溶解度是氧气的10倍。臭氧是一种强氧化剂，它的氧化能力在天然元素中仅次于氟，居第二位，在水处理中对除嗅味、脱色、杀菌、去除酚、氰、铁、锰和降低COD、BOD等都具有显著的效果。由于臭氧不稳定、易分解、因此要现场制造。用空气制成臭氧的浓度一般为10mg/120mg/l，用氧气制成臭氧的浓度为20mg/140mg/1含有1%4%（重量比）臭氧的空气或氧气就是水处理时所使用的臭氧化气。臭氧通过形成过氧化物和自由基（主要是带羟基的基团）的方式来氧化细菌生物膜。臭氧能氧化分解细菌内部氧化葡萄糖所必须的葡萄糖氧化酶等，也可以直接与细菌、病毒发生作用，破坏细胞、核糖核酸，分解DNA、RNA、蛋白质、脂质类和多糖等大分子聚合物，使细菌的物质代谢生长和繁殖过程遭到破坏。臭氧很不稳定，在常温下即可逐渐自行分解为氧。加热可以促使分解转化为氧。由于臭氧最后要变成氧臭氧分子，在通常情况下只是相对稳定，它的半衰期仅30分钟60分钟，没有任何由杀菌物质引起后续问题。经验显示0.1mg/10.2mg/1的浓