Southernblot实验方法和操作步骤

1、SouthernBlot原理及实验方法SouthernBlot原理及实验方法原理：将待检测的DNA分子用/不用限制性内切酶消化后，通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，继而将标记物标记的DNA或RNA探针进行反应。如果待检物中含有与探针互补的序列，则二者通过碱基互补的原理进行结合，游离探针洗涤后用自显影或其它合适的技术进行检测，从而显示出待检的片段及其相对大小。用途：检测样品中的DNA及其含量，了解基因的状态,如是否有点突变、扩增重排等。其变性并按其在凝胶中的位置转移到硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上，固定后再与同位素或其它试剂和器材一、试剂变性液：1.5mol/LNaCl，0.5mol/LNaOH。中和液：0

2、.5mol/LTris-HCl(pH=7.5)，1.5mol/LNaCl。20DSSC：3mol/LNaCl，0.3mol/L柠檬酸钠。以上溶液均在100Kpa灭菌20分钟。2DSSC：用无菌移液管吸取20DSSC溶液5mL，加无菌水45mL。6DSSC：用无菌移液管吸取20DSSC溶液15mL，加无菌水75mL。二、器材22CmD15Cm瓷盘操作方法在琼脂糖凝胶上电泳分离相（放一标尺，可从像片中读出将凝胶置于200mL变性液中，浸泡变为ss-DNA，然后用重蒸水冲洗凝胶几次。用中和液浸泡凝胶并不断地振荡纤维膜。取一个瓷盘，在底部放一块玻璃板DNA。取出凝胶，切去边缘多于部分，DNA迁移的距离

3、）。45分钟，并温和地不断振荡，使凝胶上的45分钟，将凝胶中和至中性。（或一块海绵）使盛器内的板表面，在玻板表面盖一张3mm的二号滤纸，滤纸两边浸没于EB染色，在紫外灯下照防止凝胶的碱性破坏硝酸ds-DNA转20倍SSC转移滤液低于玻20倍SSC溶液中，在玻璃和滤纸之间，赶掉所有的气泡。5.把凝胶底面朝上放在滤纸上，赶走两层之间出现的气泡。6.裁剪一张硝酸纤维膜，其长与宽大于凝胶先把它放在去离子水中润湿后，再放在两层之间不可有气泡。i2mm,并在角上作记号，以确定滤膜方位。20倍SSC溶液中润湿5分钟，然后放在凝胶表面，7.然后再把两张与滤膜一样大小的二号上，同样要把气泡赶走。滤纸，在2倍SS

4、C溶液中浸湿，覆盖在硝酸纤维膜8.把一叠吸水纸(或卫生纸，约有58cm高，略小于滤纸)，放置在滤纸上，在吸水纸上再放一块玻璃板和重约500g的重物，放置过夜。9.转移结束后，移去上面的吸水纸和滤纸，同时翻转取出凝胶与硝酸纤维膜，把凝胶的点样与硝酸纤维膜的相对应位置用铅笔或解剖针的针尖做好标记。11.把已转移了DNA的硝酸纤维膜放在6倍SSC溶液中振荡浸泡5分钟，然后放在滤纸上吸干溶液。再把它夹在两层滤纸之间,80真空干燥2小时。注意事项将凝胶中和至中性时，要测pH,防止凝胶的碱性破坏硝酸纤维膜。要注意赶走凝胶和滤纸及硝酸纤维素膜之间的气泡。Southern杂交简介：Southern杂交是分子生

5、物学的经典实验方法。其基本原理是将待检测的DNA样品固定在固相载体上，与标记的核酸探针进行杂交，在与探针有同源序列的固相DNA的位置上显示出杂PCR产物判断等研究中。Southern杂交。DNA样品中是否有与探针同源的片段以及该交信号。通过Southern杂交可以判断被检测的片段的长度。该项技术广泛被应用在遗传病检测、DNA指纹分析和但由于该技术的操作比较烦琐、费时，所以现在有一些其他的方法可以代替但该技术也有它的独特之处，是目前其他方法所不能替代的，如限制性酶切片段的多态性(RFLP)的检测等。一、基因组DNA的制备二、基因组DNA的限制酶切根据实验目的决定酶切DNA的量。一般Souther

6、n杂交每一个电泳通道需要10-30pg的DNA。购买的限制性内切酶都附有相对应的10倍浓度缓冲液，并可从该公司的产品目录上查到最佳消化温度。为保证消化完全，一般用24U的酶消化1pg的DNA。消化的DNA浓度不宜太高，滤纸，以0.5pg/pl为好。由于内切酶是保存在50%甘油内的，而酶只有在甘油浓度5%的条件下才能发挥正常作用，所以加入反应体系的酶体积不能超过1/10。DNA(1pg/pl)20pg10H酶切buffer4.0pl具体操作如下：在1.5ml离心管中依次加入限制性内切叮10U/p1)5.0pl加ddH20至50p1在最适温度下消化1-3hr。消化结束时可取5p1电泳检测消化效果。

7、如果消化效果不好，可以延长消化时间，但超过6hr已没有必要。或者放大反应体积，或者补充酶再消化。如仍不能奏效，可能的原因是DNA样品中有太多的杂质，或酶的活力下降。消化后的DNA加入1/10体积的0.5MEDTA，以终止消化。然后用等体积酚抽提、等体积氯仿抽提，2.5倍体积乙醇沉淀，少量TE溶解（参见DNA提取方法，但离心转速要提高到12000g,以防止小片段DNA的丢失）。如果需要两种酶消化DNA，而两种酶的反应条件可以一致，则两种酶可同时进行消化；如果反应条件不一致，子强度，再加第二种酶进行消化。则先用需要低离子强度的酶消化，然后补加盐类等物质调高反应体系的离三、基因组DNA消化产物的琼脂

8、糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳是目前分离核酸片段最常用的方法，制备简单，分离范围广（200bp-50kb），实验成本低。下表列举了不同浓度琼脂糖凝胶能分离的DNA片段范围。表：不同浓度琼脂糖凝胶分离DNA片段的范围琼脂糖凝胶浓度（%）分离DNA片段范围（kb）0.35-600.61-200.70.8-100.90.5-71.20.4-61.50.2-32.00.1-21.制备0.8%凝胶：一般用于SouthernDOODODO0.8%。DNAMarker。2.DO：电泳样品中加入6DLoading缓冲液，混匀后上样，留一或两泳道加l-2V/cm,DNA从负极O向正极。电泳至溴酚蓝指示剂接近凝胶另一端

9、时，停止DO。取出凝胶，紫外灯下观察电泳效果。在胶的一边放置一把刻度尺，拍摄照片。正常电泳图谱呈现DNA长度。一连续的涂抹带，照片摄入刻度尺是为了以后判断信号带的位置，以确定被杂交的四、DNA从琼脂糖凝胶转移到固相支持物DNA。真空法和电转转移就是将琼脂糖凝胶中的DNA转移到硝酸纤维膜卩NC膜）或尼龙膜上，形成固相转移的目的是使固相DNA与液相的探针进行杂交。常用的转移方法有盐桥法、移法。这里介绍经典的盐桥法（又称为毛细管法）。（一）试剂准备叮变性液：0.5MNaOH；1.5MNaClD叮中和液：0.5MTris-HCl（pH7.4）；1.5MNaCl;7.0，加ddH2ODDDOOD20DS

10、SCD：NaCl175.3g;柠檬酸三钠82.2g,NaOH调pH至至1000ml。（二）操作步骤1.碱变性:室温下将凝胶浸入数倍体积的变性液中30min。2.中和:将凝胶转移到中和液15min。3转移按凝胶的大小剪裁NC膜或尼龙膜并剪去一角作为标记，水浸湿后，浸入转移液中5min。剪一张比膜稍宽的长条Whatman3mm滤纸作为盐桥，再按凝胶的尺寸剪大量的纸巾备用。按下图所示进行转移。（转移过程一般需要8-24hr,每隔数3-5张滤纸和hr换掉已经湿掉的纸巾。转移液用20DSSCD注意在膜与胶之间不能有气泡。整个操作过程中要防止膜上沾染其他污物。）4.转移结束后取出NC膜，浸入60SSC溶液

11、数min,洗去膜上沾染的凝胶颗粒，置于两张滤纸之间，80C烘2hr,然后将NC膜夹在两层滤纸间，保存于干燥处。五、探针标记进行Southern杂交的探针一般用放射性物质标记或用地高辛标记。放射性标记灵敏度高棉纱，效果好；地高辛标记没有半衰期，安全性好。这里介绍放射性标记。探针的标记方法有随机引物法、很简单。切口平移法和末端标记法，有一些试剂盒可供选择，操作也以下为Promega公司随机引物试剂盒提供的标记步骤：取25-50ng模板DNA于0.5ml离心管中,100叮性2在另一个0.5ml离心管中加入：5min,立即置冰浴。Labeling5Dbuffer10|jl（含有随机引物）dNTPmix

12、2jl（含dCTP、dGTP、dTTP各0.5mM）BSA（小牛血清白蛋白）2jla-32PdATP3jlKlenow酶5U3叮变性模板DNA加入0000,0ddH20至50jl,混匀。室温或37卩1hr。4加50jl终止缓冲液终止反应。标记后的探针可以直接使用或过柱纯化后使用。由于好的探针应尽快使用。探针的比活性最好大于六、杂交a-32P的半衰期只有109计数/分/jl。14天,所以标记即探针为液相,被杂交DNA为固相。杂交发生Southern杂交一般采取的是液-固杂交方式,于一定条件的溶液（杂交液）中并需要一定的温度,可以用杂交瓶或杂交袋并使液体不断的在膜上流动。杂交液可以自制或从公司购买

13、,不同的杂交液配方相差较大,杂交温度也不同。下面给出的为一杂交液配方：PEG600010%；SDS0.5%；6DSSC；50%甲酰胺。该杂交液的杂交温度为42DD1预杂交NC膜浸入2DSSC05min,在杂交瓶中加入杂交液（8CmD8Cm的膜加5ml即可），将膜的背面贴紧杂交瓶壁，正面朝向杂交液。放入42杂交炉中，使杂交体系升到42。取经超声粉碎的鲑鱼精DNA已溶解在水或TE0D100D0DD05min,迅速加到杂交瓶0,使其浓度达到100jg/ml。继续杂交4hr。鲑鱼精DNA的作用是封闭NC膜上没有DNA转移的位点，降低杂交背景、提高杂交特异性。2杂交倒出预杂交的杂交液，换入等量新的已升温

14、至42的杂交液，同样加入变性的鲑鱼精DNA。将探针100叮热5min,使其变性，迅速加到杂交瓶中。42卩杂交过夜。七、洗膜与检测取出NC膜，在2DSSC溶液中漂洗5min,然后按照下列条件洗膜：2DSSC/0.1%SDS,42D,10min；1DSSC/0.1%SDS,42D,10min；0.5DSSC/0.1%SDS,42D,10min；0.2DSSC/0.1%SDS,56D,10min；0.1DSSC/0.1%SDS,56D,10min。在洗膜的过程中，不断振摇，不断用放射性检测仪探测膜上的放射强度。实践证明，当放射强度指示数值较环境背景高1-2倍时，是洗膜的终止点。上述洗膜过程无论在哪一

15、步达到终点，都必须停止洗膜。洗完的膜浸入2DSSC中2min,取出膜，用滤纸吸干膜表面的水份，NC膜之间不能有气泡。将膜正面向上，放入暗盒中（加双并用保鲜膜包裹，注意保鲜膜与侧增感屏），在暗室的红光下，贴覆两张X光片，每一片都用透明胶带固定，合上暗盒，置-70低温冰箱中曝光。根据信号强弱决定曝光时间，一般在1-3天时间。洗片时，先洗一张X光片，若感光偏弱，则再多加两天曝光时间，再洗第二张片子。影响Southern杂交实验的因素很多，主要有：DNA纯度、酶切效率、电泳分离效果、转移效率、探针比活性和洗膜终止点等。七、注意事项1.要取得好的转移和杂交效果，应根据DNA分子的大小，适当调整变性时间。

16、对于分子量较大的DNA片段（大于15kb），可在变性前用0.2MHCl预处理10min使其脱嘌呤。2.转移用的NC膜，否则影响DNA的转移及与膜的结合。3.转移时，凝胶的四周用Parafilm蜡膜封严，防止在转移过程中产生短路，影响转移效率，同时注意NC膜与凝胶及滤纸间不能留有气泡，以免影响转移。NC膜要预先在双蒸水中浸泡使其湿透，否则会影响转膜效果；不可用手触摸4.注意同位素的安全使用。基因组DNASouthern杂交12裁三张大小合适的3MM滤纸，用20DSSC浸湿后铺在滤膜表面。1）基因组DNASouthern印迹的制备预备1用适当的限制性内切酶消化基因组DNADOD10pg）。2进行琼

17、脂糖凝胶电泳。一般用0.7卩1.0卩的琼脂糖凝胶分离基因组DNA,它在1D15kb的范围内有较好的分辨率，可选用TBE或TAE缓冲液。琼脂糖凝胶电泳需在1V/cm的电压下进行，屏风，如果要分离片段大小相似的DNA带，应用较大的凝胶D20D25cm）。常用的标准品是由Hind叮化的入DNA、Hae叮化的X174DNA和100或1000bp的梯形图谱。电泳完毕，将凝胶放在紫外透射仪上，并在凝胶旁放一尺子进行拍照。当把凝胶从盘内移动紫外透射仪时，小心不要将凝胶滑落或弄破。Southern印迹的制备1将凝胶转移至塑料盒内。2叮入至少4倍凝胶体积的0.25mol/LHCl使DNA脱嘌呤，置室温摇床温育1

18、5min。这时凝胶上样缓冲液中的溴酚蓝应变黄色，如果15min后仍呈蓝色，应再温育5min。3小心地塑料盒内HCl弃去，用蒸馏水漂洗凝胶一次。4加入至少4倍体积的变性缓冲液，置室温摇床温育20min。5用新鲜缓冲液重复步骤4，小心弃去变性缓冲液，用蒸馏水稍加漂洗。6加入至少4倍体积的中和反应缓冲液，置室温摇床温育15min。7用新鲜缓冲液重复步骤6。8当处理凝胶时，裁一张略大于凝胶的滤膜（硝酸纤维膜或尼龙膜），预先用蒸馏水将滤膜浸湿后用20DSSC浸泡至少15min。9叮装转移装置。在盘中加入印迹缓冲液（20DSSC）,在缓冲液面作一平台，比如可倒置一凝胶盘，上面盖三张经20DSSC饱和过的滤

19、纸（Whatman3MM）,平台两侧的滤纸应浸泡在缓冲液中，用10ml的玻璃吸管在其表面小心滚动以赶出所有气泡，并将滤纸推平。10D倒数毫升20DSSC于滤纸表面，将凝胶面向下倒扣在滤纸上，小心赶出凝胶与滤纸间的气泡，凝胶四周用胶布或塑料薄膜包裹以防缓冲液从凝胶周围直接流至纸中（虹吸短路）。11叮数ml20DSSC浸没凝胶，表面覆以滤膜，确保凝胶与滤膜之间无气泡。13放一叠干燥的吸水纸（印迹纸或纸巾）在3MM滤纸上（约5D8cmODD14置一玻璃板于吸水纸上，其上放一重约0.75卩1kg的物体。20DSSCD1D3LDD滤纸上，凝胶115卩DNA转移可进行12D16h（如过夜D,确保槽内有足够

20、的16毛细管虹吸转移完毕，小心拆卸印迹装置。将膜与凝胶一起转移至干燥的在上，用软铅笔标记凝胶和滤膜的加样孔位置，撕去凝胶。17D05DSSC漂洗杂交膜以去除琼脂糖残迹。18叮滤膜放在一张干燥的3MM滤纸上稍微晾干。19D00DNA于滤膜上，若用硝酸纤维素膜，在80卩真空箱中烤2h；若用尼龙膜，将DNA面朝下暴露于紫外透射仪3D5minD20卩这时的滤膜已可用于杂交，或贮存在4。硝酸纤维素膜需真空保存，尼龙膜需用塑料薄膜密封。2DDNA印迹杂交1D05DSSPE浸渗DNA滤膜。2将浸湿的DNA滤膜放入塑料袋内，袋的四边密封并剪去一角。3从缺口处加入预杂交液（0.1ml/cm2D，避免加入气泡，将袋中的气泡全部挤出，封口。4叮塑料袋置水浴摇床中温育，或夹在两块玻璃板中置65DD02D4小时，确保滤膜表面无气泡。5D095D10min使探针变性，立即置冰浴冷却