微生物限度检查方法学验证方案

1、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺微生物限度检查方法验证方案报告编号：SVL-VP020-11密级：保密文件 主责部门：质量控制部执行日期：二 0 年七 月 二十一 日文 件 目 录序 号内 容页 码1验证审批第3页2验证小组成员、职责第3页3验证支持文件第4页4仪器校验第5页5验证具体内容第5页概述第5页验证目的第5页验证时间第5页验证内容第6页6验证结果第13页7偏差处理情况第13页8验证评价第14页9验证报告审批第14页10数据附件（原始数据）第14页1. 验证审批：部 门姓 名主责部门起草人张金花质量部QC主管审核顾黎娟验证领导小组副组长张广永验证领导小组组长张新荣2验证小组成员、职责：姓 名部

2、门 / 职务验 证 分 工验证小组组长，负责验证方案编制并组织实施批准后的方案及验证资源的协调，汇总并形成验证报告。 负责验证工作中的协调工作，以保证本验证方案规定项目的顺利实施；负责对相关文件和资料进行检查。偏差情况的调查、分析、处理和汇总。负责设备操作，并对操作参数进行记录。负责审核验证方案和报告，对检验结果作出评价和建议。负责对相关文件和资料进行检查复核；负责取样和检验结果汇总负责检验结果复核, 检验记录审核。负责样品检验。负责样品检验。配合验证实施，保证验证设备运转正常。3. 验证支持文件序 号文 件 名 称文 件 编 号1验证管理规程2验证文件管理规程3清洁验证管理规程4工作服管理规

3、程5洁净区卫生管理规程6-型洗衣机操作程序7-型干衣机操作程序8清洁剂和消毒剂配制使用操作程序9清洁工具清洁与消毒操作程序10洁净区容器具清洁操作程序11-型洗衣机清洁操作程序12-型干衣机清洁操作程序13洗衣工序清场14微生物限度检查法操作程序检查人： 日 期：复核人： 日 期：4. 仪器校验：序号仪器名称及型号器具编号有效期至检定单位检定证书编号1培养箱2培养箱3 立式压力灭菌锅（压力表）鼓风干燥箱架托天平检查人： 日 期： 复核人： 日 期：5验证具体内容：5.1 概述：根据中华人民共和国药典2010年版二部附录C微生物限度检查法的要求，为保证验证检验质量，确保检验结果的准确性和可靠性，

4、对微生物限度方法学验证工作进行了考察，现将测定结果报告如下： 验证目的：为确保所采用的方法适合于该药品微生物限度检查，特进行方法学验证试验。判断标准：试验组的菌数回收率均不低于70%，照该供试液制备方法和计数法测定供试品的细菌、霉菌及酵母菌数、限制菌数。试验内容.1供试品：L-丙氨酰-L-谷氨酰 批号 、 、 .2培养基：营养琼脂培养基（ ）、营养肉汤培养基（ ）、玫瑰红钠琼脂培养基（ ）、改良马丁琼脂培养基（ ）、4-甲基伞形酮葡糖苷酸（ ）、胆盐乳糖培养基（ ）、改良马丁培养基（ ）以上培养基均由中国药品生物制品检定所提供。.3试验菌种 大肠埃希菌 、金黄色葡萄球菌 、枯草芽孢杆菌 、白色

5、念珠菌 、黑曲霉 .以上菌种均由中国药品生物制品检定所提供。6、菌液的制备6.1 接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基10ml中，30356.2 取经3035培养1824小时的大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的营养肉汤培养基各1ml加到9ml的0.9%无菌氯化钠溶液中，采用10倍递增稀释法，稀释至10-510-76.3 接种白色念珠菌新鲜培养物至改良马丁培养基中，23286.4 取经2328培养4872小时培养的白色念珠菌1ml含加到9ml0.9%无菌氯化钠溶液中，采用10倍递增稀释法，稀释至10-410-66.5接种黑曲霉新鲜培养物至改良马丁琼脂培

6、养基中，23286.6取经2328培养57天的黑曲霉新鲜培养物，加入35ml 含0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱，然后吸出孢子悬液至无菌试管内，按10倍递增稀释法，稀释至10-510-76.7菌数计数：6分别取大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌3种菌液（100cfu/ml）1ml注入无菌培养基中，每种菌液平行2个平皿，注入456分别取白色念珠菌,黑曲霉2种菌液(100cfu/ml)1ml注入无菌培养皿中,每种菌液平行2个平皿,注入45左右的改良马丁琼脂培养基约1520ml,2328表1L-丙氨酰-L-谷氨酰菌名金黄色葡萄球菌大肠埃希菌枯草芽孢杆菌白色念珠菌黑曲霉稀释级10-61ml10

7、-61ml10-61ml10-51ml10-51ml1 2 平均数 注：金黄色葡萄球菌（第 代）、大肠埃希菌（第 代）、枯草芽孢杆菌（第 代）、白色念珠菌（第 代）、黑曲霉（第 代）。7、方法验证：7.1 方法：采用平皿计数法7.2 稀释剂：0.9%无菌氯化钠蛋白胨缓冲液（PH=7）0.9%无菌氯化钠溶液7.3 取样量：按中国药典2005年版规定的取样方法，供试品的检验量为10g。7.4 供试品：取供试品10g蛋白胨缓冲溶液100 ml中，振摇，使成1：10的的供试液。7.5 试验方法7试验组：取供试液1ml（1：10）注入无菌平皿中，分别注入5种（50-100cfu/ml）的试验菌，并立即倾

8、注45左右的营养琼脂培养基与改良马丁琼脂培养基约1520ml，营养琼脂培养基在3035培养48小时；改良马丁琼脂培养基在237菌液组：取各菌种液1ml（50-100cfu/ml，同6.5.1操作，按平皿法计数菌数）。7供试品对照组：依照微生物限度检查操作规程，取供试品10g，加PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，振荡，溶解混匀，分别制备1：102及1：103的供试液，取供试液1ml（1：10），同6.5.1操作，按平皿法测定供试品本底菌数。7稀释剂对照组：稀释剂为0.9%无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液（PH=7），无抑菌作用，不作考察。8、实验结果记第一次：表1 大肠埃希菌的回收率：试验

9、组菌液组供试品对照组回收率菌数皿1皿2皿1皿2皿1皿2 表2 金黄色葡萄球菌的回收率：试验组菌液组供试品对照组回收率菌数皿1皿2皿1皿2皿1皿2 表3 枯草芽孢杆菌的回收率：试验组菌液组供试品对照组回收率菌数皿1皿2皿1皿2皿1皿2 表4 白色念珠菌的回收率：试验组菌液组供试品对照组回收率菌数皿1皿2皿1皿2皿1皿2 表5 黑曲霉的回收率：试验组菌液组供试品对照组回收率菌数皿1皿2皿1皿2皿1皿2 第二次：表1 大肠埃希菌的回收率：试验组菌液组供试品对照组回收率菌数皿1皿2皿1皿2皿1皿2 表2 金黄色葡萄球菌的回收率：试验组菌液组供试品对照组回收率菌数皿1皿2皿1皿2皿1皿2 表3 枯草芽孢

10、杆菌的回收率：试验组菌液组供试品对照组回收率菌数皿1皿2皿1皿2皿1皿2 表4 白色念珠菌的回收率：试验组菌液组供试品对照组回收率菌数皿1皿2皿1皿2皿1皿2 表5 黑曲霉的回收率：试验组菌液组供试品对照组回收率菌数皿1皿2皿1皿2皿1皿2 第三次：表1 大肠埃希菌的回收率：试验组菌液组供试品对照组回收率菌数皿1皿2皿1皿2皿1皿2 表2 金黄色葡萄球菌的回收率：试验组菌液组供试品对照组回收率菌数皿1皿2皿1皿2皿1皿2 表3 枯草芽孢杆菌的回收率：试验组菌液组供试品对照组回收率菌数皿1皿2皿1皿2皿1皿2 表4 白色念珠菌的回收率：试验组菌液组供试品对照组回收率菌数皿1皿2皿1皿2皿1皿2

11、表5 黑曲霉的回收率：试验组菌液组供试品对照组回收率菌数皿1皿2皿1皿2皿1皿2 9.测定结果：按照中国药典2010年版微生物限度检查法中常规法检查，金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉的回收率均高于70%，无抑菌作用，可照该供试液制备方法和计数法测定供试品的细菌和霉菌及酵母菌。10控制菌检查：按照中国药典2010年版微生物限度检查法进行控制菌的方法学验证试验及检查。10.1大肠埃希菌10菌液制备：大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌同6.1、6.2项下供试液的制备。10供试液的制备：同7.4项下供试液的制备。10验证方法10.1试验组大肠埃希菌 取供试液（1：10）10ml，加

12、入胆盐乳糖培养基100ml中，重复两份，其中1份为供试品组，另一份加入大肠埃希菌10100cfu/ml作为试验组，另取大肠埃希菌10100cfu/ml加入胆盐乳糖培养基100ml中作阳性对照，3035培养1824小时，取上述增菌液0.2ml，加入5mlMUG试管中，置303510.2阴性对照组 取供试液（1：10）10ml，加入胆盐乳糖培养基100ml中，加入金黄色葡萄球菌10100cfu/ml作为阴性对照，3035培养1824小时，取上述增菌液0.2ml，加入5mlMUG试管中，置3035表3 L-丙氨酰-L-谷氨酰阳性组供试品组试验组大肠埃希菌MUG颠基质MUG颠基质MUG颠基质阴性菌-金

13、黄色葡萄球菌（23cfu/ml）注：金黄色葡萄球菌的稀释级为10-710.2大肠菌群 按照中国药典2010年版微生物限度检查法进行大肠菌群的方法学验证试验及检查。10菌液制备：大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌同6.1、6.2项下供试液的制备。10供试液的制备：取7蛋白胨缓冲溶液9 ml，即为1：1000的供试液.10验证方法.1试验组 取含10ml的胆盐乳糖发酵培养基管3支，分别加入1：10的供试液1ml、1：100的供试液1ml、1：1000的供试液1ml，重复2份，其中1份为供试品组，另一份加入大肠埃希菌10100cfu/ml作为试验组，另取大肠埃希菌10100cfu/ml加入胆盐乳糖发酵培养基

14、管中作阳性对照，303510.2阴性对照组 取含10ml的胆盐乳糖发酵培养基管3支，分别加入1：10；1：100；1：1000的供试液1ml，再分别加入金黄色葡萄球菌10100cfu/ml作阴性对照，3035表4 L-丙氨酰-L-谷氨酰实验组菌数（个/ml）1：101：1001：1000检出结果（个/g）供试品组阳性对照组（大肠埃希菌）试验组阴性对照组（金黄色葡萄球菌）11结论根据上述验证试验结果，确定本品微生物限度检查方法测定即可。样品测定11.1细菌、霉菌和酵母菌总数的测定样品测定结果见表6表6 L-丙氨酰-L-谷氨酰胺批号项目细菌总数测定霉菌和酵母菌总数测定稀释倍数1：1011：1021

15、：103阴性对照1：1011：1021：103阴性对照12均值结论稀释倍数1：1011：1021：103阴性对照1：1011：1021：103阴性对照12均值结论稀释倍数1：1011：1021：103阴性对照1：1011：1021：103阴性对照12均值结论11.2大肠埃希菌测定 测定结果见表7.表7 L-丙氨酰-L-谷氨酰批号MUG-1结果5小时24小时阴性对照阳性对照11.3大肠菌群测定 测定结果见表8.表8 L-丙氨酰-L-谷氨酰批号可能的大肠菌群数N(个/g)阴性对照阳性对照由上述检测结果可知，样品符合规定12. 验证结果：撰写人： 日期：复核人： 日期：13偏差处理情况：13.1. 验证过程中，若出现不需改变本验证方案的偏差，则进行偏差处理后继续实施验证，同时将纠偏措施和纠偏结果记录在验证报告之中；13.2. 验证