分子生物学-DNA的复制

1、第五章 DNA的复制(DNA Replication )DNA复制 亲代双链DNA分子在DNA聚合酶的作用下，分别以各单链 DNA分子为模板，聚合与自身碱基可以互补配对的游离的dNTP，合成出两条与亲代DNA分子完全相同的子代DNA分子的过程。复制子(Replicon，复制单位或复制元) DNA中含有一定复制起点和复制终点的复制单位。 复制子的长度大小不均，1.3万90万bp不等。DNA的半保留复制（Semi-Conservation Replication） 概念： 复制过程中各以双螺旋DNA的其中一条链为模板合成其互补链，新生的互补链与母链构成子代DNA分子 。理论上DNA的复制也可采用其

2、它方式，如叫全保留复制(conservative replication)和分散模型（dispersive model）的复制方式也是可能的。第一节半保留复制的验证 半保留模型（semioconservetive model） 全保留复制模型(conservetive model) 分散模型(Dispersive model)。验证半保留复制的实验一、Meselson-Stahl实验 二、Taylar实验 三、姐妹染色单体差别染色方法（sister- chromatid differential staining）5溴脱氧尿嘧啶（5-Bromodeoxy uridine，简称BUdR） 斑色染

3、色体（Harlequin chromosome） 四、Cairns复制模型型复制 图11-4 Taylor 蚕豆根尖放射自显影实验。(a)按半保留复制预期DNA在复制过程中标记情况；(b)实验结果染色体放射自显影的图示。第二节参与DNA复制的酶和蛋白一、快停突变与慢停突变快停突变：把细菌培养温度提高（42 45）复制迅速停止。快停突变所涉及的产物和链的延伸有关慢停突变：将细菌培养温度提高，DNA合成并不立即停下来，延续一段时间后合成才会停止。慢停突变表明突变的基因和复制起始有关。筛选出与DNA合成、延伸有关的蛋白和酶。二、复制的酶系统（一）DNA聚合酶1.DNA聚合酶的共同特点（1）需要提供合

4、成模板；（2）不能起始新的DNA链，必须要有引 物提供3OH；（3）合成的方向都是53（4）除聚合DNA外还有其它功能。 表11-1 E.coli 中的三种DNA多聚酶 DNApolDNApol DNA pol 结构分子量 109 KD90 KD900 KD构成 单体单体异多聚体分子数/细胞 400？10-20酶活性：5 3聚合酶 +35外切酶 +53外切酶 +(可切单链)突变体突变位点pol Apol BpolC(dnaE), dnaN, dnaZX, dnaQ, dnaT突变表型修复有缺陷能修复阻止复制复制的特异性（复制的忠实性）：(1)合成前（presynthetic）错误控制：能够通过

5、匹配的化学特点加以识别，检查进入的碱基是否和模板互补，这是一种合成前的预防措施。(2)校正（proofreading）控制：在新的碱基加到链上以后，来检查碱基是否配对。发生错配时，会把刚加上去的错误碱基切除。2.DNA聚合酶的结构和功能DNA聚合酶有6个结合位点：(1) 模板结合位点；(2) 引物结合位点；(3) 引物3OH结合位点；(4) 底物dNTP结合位点；(5) 53外切酶结合位点；(6) 35校正位点。 3、DNA聚合酶的功能 特点：主要用于DNA的修复和后随链中RNA引物的置换。使用的模板范围较宽（1）有引物的ssDNA（线状或环状）。（2）有缺口的dsDNA（无论大小）；（3）有

6、切口（nick）的双链DNA。 1. 53聚合功能 2. 35外切活性 3. 53外切活性 (1)切口平移（nick translation）； (2)链的置换； (3)模板转换（template-switching） 4. 内切酶活性4、DNA多聚酶的结构DNA pol 全酶在DNA上的装配分为三个阶段：（1）一个二聚体加上一个复合体识别引 物模板形成一种前起始复合物。（2）DNA在于,复合体结合的位点构象 发生改变，而对核心酶产生了高亲和。 使核心酶能与DNA结合。（3）二聚体结合核心聚合酶，使其二聚化。（二） DNA连接酶 其作用机制是分三步进行：1、EATPEAMPppi 在E.col

7、i中， ENADEAMPNMN（烟酰胺单核苷酸）2、E-AMP上的AMP转移到DNA的5-PO4上使其活化3、活化的5PO4与相邻的3OH作用形成35 磷酸二酯键，并释放出AMP。（三） 单链结合蛋白单链结合蛋白（single strand binding protein,SSB）又称为双螺旋去稳定蛋白（helix destabilizing protein）由177个aa组成在E.coli 中以四聚存在分子量为74KDa ，每个分子可以覆盖32nt在原核中SSB与DNA结合表现出协同效应。（1）SSB之间的相互作用；（2）第一个SSB和DNA的结合改变了DNA的结构。（四）解旋酶(helic

8、ase)(五）DNA拓扑异构酶(topoisomerase)DNA拓扑异构酶是可以切断DNA链又能重新连接DNA的一种酶。 可以分为两类：型拓扑异构酶 型拓扑异构酶第三节复制的起点、方向和终点 一. 研究方法： 1 用同位素标记电镜观察2. 用噬菌体插入标记法 同步培养 不同步培养 3. 变性定性法（denaturation mapping） 4. 双向电泳法不同步培养时各标记的拷贝数不同,复制起点标记的拷贝数应最多二、不同生物复制起点和方向 E.coli定点、双向对称复制。 T7在近一端的17处开始，向两端延伸。 真核有多个复制起点（i），双向等速复制。 枯草杆菌有固定的起始点，双向不对称复

9、制。 质粒R6K早期为单向复制，复制了约1/5时基因 组进行双向复制。 质粒Col E1有固定起始点，但却为单向复制。 mt DNA进行D（displaced loop）环复制 D环复制三、原核生物，噬菌体和病毒的复制起始和终止(一).环状DNA的复制:1、双链DNA的复制E.coli复制起始区的结构特点是：（1）富含AT，这可能和双链易于解开起始复制有关；（2）含有多个回文结构（914个GATC）8个GATC较保守,CATC中的“ A”已甲基化;（3）具有 4个重复顺序，作为蛋白结合位点；（4）此顺序的右侧毗邻区域有两个起动子，其可能的作用是：转录产生引物；产生复制必要的蛋白；产生调节功能的

10、RNA；起转录激活作用。复制起始的简单步骤：1、转录激活：在起始区双链必须打开一小段，这主要是依赖RNA聚合酶在附近的转录，将双链打开，这种作用就叫做转录激活。2、双链解开的这一点延着DNA向边延伸扩大，产生复制叉。3、开始合成引物。4、引物合成后，DNApol组装都引发的RNA上，完成复制体的组装。2、单链DNA的复制：1968年Gilbert提出滚环复制模型:（1）共价延伸；（2）模板链和新合成的链 分开;（3）不需RNA引物，在正 链3OH上延（4）只有一个复制叉;（5）形成多联体（concatemer ）; 滚环复制的电镜照片 哪些DNA进行滚环复制?真核rDNA的扩增,F因子DNA的

11、转移,裂解途经的复制, X174,M13.G4等单链环状DNA噬 菌体 第二阶段复制都是进 行滚环复制的.（二）线状DNA复制DNA末端起始复制DNA中间起始复制DNA中间起始复制DNA末端起始复制线性双链DNA的复制有的是从一端开始的: 腺病毒（Adenovirus） 29 DNAs 脊髓灰质病毒（poliovirus)腺病毒DNA全长35937 bp,线性双链，两端各有反向重复顺序103162 bp，两末端各有50 bp为复制起点。其复制是以单链置换（strand displacement）形成一个大的茎环或叫平锅形结构来进行的。（三）复制的终止1.E.coli的复制终止(环状DNA复制终

12、止)现已发现有两个终止区域（terE,D,A和ter F,C,B），位于相遇点的另一侧100Kb处。每一终止顺序对某一方向移动的复制叉来说是特异的。ter顺序有一个23bp的区域，在体外可导致复制的终止，但其功能显示了一定的方向性。终止需要tus(terminus utilization substance)基因的产物Tus(36kD)， Tus能识别ter保守顺序，并阻止复制叉继续前进。ter-Tus复合物可能通过抑制螺旋酶来实行终止2.线性DNA的复制终止 两个5有空缺的分子通过3端凸出的重复序列互补配对。 DNA多聚酶从3端延伸填补起这个空缺，留下最后的裂隙由连接酶封闭，产生了一个大分子

13、串联体。 由限制酶在连接处交错切割，产生3 凹端，由DNA多聚酶在3-OH上延伸填满新的空缺，产生两条完整的双链。 第四节 复制的过程 1、冈崎片段 任何一种DNA聚合酶合成方向都是从5向3方向延伸，而DNA模板链是反向平行的双链，这样在一条链上，DNA合成方向和复制移动方向相同（前导链），而在另一条模板上却是相反的（后滞链）。那么在复制叉中新链是如何合成的呢？一、半不连续复制 Reiji Okazaki在DNA合成实验中添加放射性的脱氧核苷酸前体观察到前导链连续合成，滞后链分段合成。这些分段合成的新生DNA片段称冈崎片段。细菌冈崎片段长度1000-2000核苷酸，真核生物冈崎片段长度100-

14、200核苷酸。冈崎实验 （1）脉冲标记实验（pulse-labeling experiment） 以E.coli为材料，在培养时，培养基中加入同位素3H标记的dTTP，经30秒后，DNA刚开始复制，分离DNA，然后在碱中沉淀，变性，让新合成的单链和模板链分开，再用CsCl密度梯度离心，以沉降的快慢来确定片段的大小，再检测放射标记，结果表明被3H标记的片段，也就是新合成的片段，沉淀系数为20S左右，即都是长10002000Nt的DNA片段，而亲本链要比它大2050倍。 （2）脉冲追逐实验 早期合成的DNA片段以后的命运又是如何的？是依然如旧的短片段，还是连接成了长片段。这个实验是先进行标记培养3

15、0秒，以后除去同位素继续培养几分钟，再分离DNA在碱中沉淀，检测结果。先合成的（带标记）的DNA不再是短片段，而和总DNA的情况相似，沉淀系数为70S120S较长的片段，这意味着刚开始合成的片段都是短片段，以后再连接成长片段，人们就把最初合成的短片段称为冈崎片段（Okazaki fragment）。 细胞内都存在有dTTP和dUTP，而DNApol却并不能区分它们，因此也会将dUTP加入到DNA中，形成AU对。那么在DNA中为什么没有U的存在呢？这是因为E.coli细胞里有双重“保险”，防止了U的“混入”。第一道关是细胞里的dUTPase，它能使dUTP变成dUMP，dUMP是不能作为DNA合

16、成的底物，这样它就不再能加入DNA中。 第二道关是尿嘧啶N-糖苷酶（uracil N-glycosylase），它可以切断混合尿苷的糖苷键，形成无Pu和Py位点（apurinic or apyrimidinic ，AP），再由AP内切酶在AP位点切出一个缺口，进一步进行切除修复。在细胞内尿嘧啶N-糖苷酶作用较快，而AP酶作用较慢，在新链合成之初约1200bp就有可能掺进一个U，但很快就被尿嘧啶N-糖苷酶切断糖苷键，在AP酶未作用前在脉冲标记实验中就提取了，用NaOH沉淀时，AP位点十分易断裂，所以前导链也成了小片段。 E.colidUTPase，它能使dUTP变成dUMP，dUMP是不能作为D

17、NA合成的底物，这样它就不再能加入DNA中。尿嘧啶N-糖苷酶（uracil N-glycosylase），它可以切断混合尿苷的糖苷键，形成无Pu和Py位点（apurinic or apyrimidinic ，AP），再由AP内切酶在AP位点切出一个缺口，进一步进行切除修复。实验证实(1)在dut -突变体（dUTPase缺失）中冈崎片段比在dut +中短。这是因为U掺入机会增加；(2)在ung- （尿嘧啶N-糖苷酶缺失）突变体中，新合成的DNA约有一半由片段组成。(3)因为尿嘧啶N-糖苷酶缺失，不会切除U的糖苷链，也就不会出现AP位点，所以碱沉淀时不易断裂，从而保持了半不连续的原貌。在dut-

18、, ung-双突变体中，结果和实验（2）相同，更进一步证实了此推测。2、复制过程复制过程的特征： 1、DNA的聚合反应是以dNTP为底物，以带有引物的DNA为模板，按碱基互补配对的原则在3-OH上加一个dNTP2、 需要二价正离子如Mg2+，由引物提供的3-OH作亲本进攻形成磷酸二酯键 3、链沿5到3方向延长4、碱基互补配对时，若错配则被先切除掉5、反应具有进行性， DNA聚合酶从DNA上解离下来前可催化多次反应3、链的延伸链的合成方向和复制叉移动方向相同的是前导链，相反的是后随链。前导链连续延伸，后随链合成较为复杂。双螺旋复制是同时复制的：每一个复制叉含有特别大的多聚体复合体，它是一个不对称

19、的二聚体，可能同时催化两条链。在电镜下观察到双螺旋DNA聚合酶也同样具有两个活性部位 复制体（replisome）：是由解旋酶、引发酶和DNA Pol 全酶组成的复合体。4、复制体和回环模型回环模型： DNA合成时，沿着复制叉的方向移动。后随链模板形成了一个回环，使环中RNA引物和冈崎片段的合成方向与前导链一致，以适应双链在同一复制体上进行复制。特点：聚合酶和引发体联系在一起可以协调它们的作用；复制体中的DNA Pol 是二聚体；后随链是形成回环复制的。 二、真核生物的复制、真核生物聚合酶和有关蛋白、真核生物复制特点基因组中有多个复制起点 一般要等第一轮复制结束后第二轮才开始。 真核的复制起点

20、到两边的复制终点称为一个复制子（replicon）或一个复制单位（replicationunite）。DNA开始合成的位置，一个初始起点(或者双向复制起点-大多数起点是双向的)，两侧有一些二级起点。初始起点经常是0.5-2kbp长，而二级起点可跨越50kbp，因此称为起始地带(initiation zone) 真核和原核复制子的大小是非常相似的，但复制的速率真核要比原核慢得多真核的复制起始点的数目和复制单位的大小是随着细胞的特点变化而改变的，如不同的生长速率的细胞和不同组织的细胞。 并非所有的复制子都同时进行DNA复制。而是有一定的起始时间顺序。不同类型的细胞复制起始的顺序也不同。在不同的发育

21、时期，真核的复制起点和复制子的大小是会改变的，有些复制起点在有的发育阶段就不再发挥作用 真核的复制起始区的顺序称为自主复制顺序 真核DNA复制时DNA聚合酶有五种()，原核只有三种。 真核细胞内DNA引物酶和pol紧密偶联，而在原核细胞内引发酶是和解旋酶偶联一起，形成复制体的一部分。 、真核生物复制起始区结构(1)T蛋白具有解链酶活性，通过水解ATP解开双链，RF-A立即和单链结合，使之稳定；(2)复制叉移动一段距离，pol-引物酶复合物结合到复制区，合成第一段RNA引物；(3)RF-C结合到引物上，使pol合成第一条冈崎片段；(4)到前导链和后滞链的分界区，pol从单链上解下来，再结合到新的

22、复制叉处合成后滞链。(5)pol，RF-C和PCNA结合到前导链的第一条冈崎片段3端开始合成前导链。(6) SV40的复制可能也形成复制体，后滞链形成回环 酵母的自主复制区ARS(autonomously replicationg sequence)发挥复制起点的功能，但是过量的。酵母染色体的着丝粒附近为ARS1序列ARS1分为A,B,C三个功能区, A,B起主要作用,C起次要作用。A区为15bp,其中11个保守，称ACS (ARS consensus sequence)。有复制起始子的功能B区约为80bp,含B1,B2,B3三个功能区。B3是ABF1（ARS-binding factor 1）结合区。酵母的复制ORC：由6个亚基组成相当于Dna A和 的O蛋白，与 A/B1结合，结合于游离的DNA Cdc6:相当于DnaC,及的P蛋白，使Mcm蛋白结合到复合体上。此对在Origin上起始复制是必须的。 Mcm: DnaB 螺旋酶。即 licensing factorABF1（转录因子）结合于B3三、原核和真核生物复制体系比较E.coli SV40/人 酵母 功能 DnaA O T抗原 ORC 起始蛋白 DnaB Dn