荧光定量原理和应用第二版

1、关于荧光定量原理与应用第二版第一张，PPT共五十页，创作于2022年6月提纲 PCR简介 荧光定量PCR技术原理 荧光化学物质简介定量方法实时荧光定量PCR技术简介：第二张，PPT共五十页，创作于2022年6月PCR概念什么是PCR？Polymerase Chain Reaction (PCR)聚合酶链反应是在体外选择性的扩增特定DNA片段的方法。第三张，PPT共五十页，创作于2022年6月Classic PCR第四张，PPT共五十页，创作于2022年6月Classic PCR第五张，PPT共五十页，创作于2022年6月PCR 循环第一步 加热变性、双链打开第二步退火、引物与单链结合第三步 -

2、 引物延伸变为两个双链DNA第六张，PPT共五十页，创作于2022年6月第七张，PPT共五十页，创作于2022年6月常规PCR常规PCR技术：PCR后借助电泳对扩增反应的终产物进行定量及定性分析S1 S2 MDNA Engine第八张，PPT共五十页，创作于2022年6月提纲 PCR简介 荧光定量PCR技术原理 荧光化学物质简介 定量方法实时荧光定量PCR技术简介：第九张，PPT共五十页，创作于2022年6月定量PCR定量PCR技术：利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线实现对起始模板的定量分析IQ5 Real-time PCR仪第十张，PP

3、T共五十页，创作于2022年6月PCR反应混合物Mg2+Mn2+dCTPdGTPdUTPdATPTaq DNA多聚酶引物模板DNA或缓冲液荧光物质第十一张，PPT共五十页，创作于2022年6月提纲 PCR简介 荧光定量PCR技术原理 荧光化学物质简介定量方法实时荧光定量PCR技术简介：第十二张，PPT共五十页，创作于2022年6月 SYBR Green 1 TaqMan荧光化学第十三张，PPT共五十页，创作于2022年6月SYBR Green ISYBR Green 1第十四张，PPT共五十页，创作于2022年6月SYBR Green I 工作原理 SYBR Green 1 结合到双链DNA的

4、小沟部位 SYBR Green 1染料结合状态时荧光强度是非结合状态的800-1000倍GTTTGGCCCCCCCAAAGGGACTTGATAGCATCGTAA第十五张，PPT共五十页，创作于2022年6月SYBR Green I第十六张，PPT共五十页，创作于2022年6月SYBR Green I第十七张，PPT共五十页，创作于2022年6月SYBR Green I第十八张，PPT共五十页，创作于2022年6月与传统PCR的比较实现了初始模板的绝对定量检测灵敏度高可以检测到低拷贝的目的基因可以区分微小的拷贝数差异可以对初始模板含量差异较大的样品同时定量省时省力检测设计灵活第十九张，PPT共五

5、十页，创作于2022年6月Melt Curve Analysis第二十张，PPT共五十页，创作于2022年6月Melt Curve Analysis第二十一张，PPT共五十页，创作于2022年6月SYBR Green I 优点 使用方便 - 不必设计复杂的荧光探针 没有序列特异性 - 可以用于不同的模板 便宜 灵敏第二十二张，PPT共五十页，创作于2022年6月SYBR Green I 缺点 与非特异性产物结合第二十三张，PPT共五十页，创作于2022年6月TaqMan探针荧光素淬灭剂TaqMan水解型杂交探针第二十四张，PPT共五十页，创作于2022年6月TaqMan 目标特异性探针 5为荧

6、光素， 3为淬灭剂5 荧光素3淬灭剂与目标序列互补第二十五张，PPT共五十页，创作于2022年6月TAQMAN Probes第二十六张，PPT共五十页，创作于2022年6月TAQMAN Probes第二十七张，PPT共五十页，创作于2022年6月TAQMAN Probes第二十八张，PPT共五十页，创作于2022年6月TAQMAN Probes第二十九张，PPT共五十页，创作于2022年6月TaqMan优点对目标序列有很高的特异性 -特别适合于SNP检测第三十张，PPT共五十页，创作于2022年6月TaqMan缺点 价格较高 只适合于一个特定的目标 不能进行融解曲线分析 背景高第三十一张，PP

7、T共五十页，创作于2022年6月兼容化学试剂总结结合于双链DNA的小沟中发夹型杂交探针水解型杂交探针（5-3外切）延伸复性任何步骤定量和检测目标基因融解曲线分析SNP分析定量和检测目标基因SNP分析定量和检测目标基因信号检测工作原理有否淬灭剂化学试剂否有有主要应用范围第三十二张，PPT共五十页，创作于2022年6月荧光曲线 随着PCR反应的进行，扩增产物不断累积，荧光信号强度不断增加。每经过一个循环，收集一次荧光强度信号，得到一条荧光扩增曲线图第三十三张，PPT共五十页，创作于2022年6月定量原理 如何对起始模板定量？ 通过Ct值和标准曲线实现对起始模板的定量分析 引入两个概念： 荧光阈值、

8、Ct值第三十四张，PPT共五十页，创作于2022年6月定量原理荧光阈值在荧光扩增曲线指数增长期设定一个荧光强度标准(即PCR扩增产物量的标准)阈值线第三十五张，PPT共五十页，创作于2022年6月Ct值的概念定量原理Ct值的定义是PCR扩增过程中，扩增产物(荧光信号）到达阈值时所经过的扩增循环次数C(t) 值C(t) 值18.12 +/0.04-阈值线第三十六张，PPT共五十页，创作于2022年6月提纲 PCR简介 荧光定量PCR技术原理 荧光化学物质简介定量方法实时荧光定量PCR技术简介：第三十七张，PPT共五十页，创作于2022年6月 绝对定量 确定初始模板的准确含量 需要标准曲线 相对定

9、量 确定样品间初始模板的含量倍数差异 相对标准曲线 不使用标准曲线，利用Ct值计算 Ct方法 Ct方法（看家基因） Pfaffl方法（考虑扩增效率） Vandesompele方法（多看家基因）14500 copies定量方法 第三十八张，PPT共五十页，创作于2022年6月借助标准曲线由未知样品的C(t)值反推出其初始量得到未知样品初始量绝对值unknown104103Unknown contains 3108 copies绝对定量第三十九张，PPT共五十页，创作于2022年6月 CT 法相对定量 无均一化处理 均一化依赖于加样的一致性相对定量CT Sample1 Ct1 (25) Sampl

10、e2 Ct2 (22)CT=Ct1-Ct2 =25-22=3基因表达量Sample1/Sample2=2 CT= 2-3=1/8第四十张，PPT共五十页，创作于2022年6月相对定量CTCT法相对定量 考虑到了加样误差 通常使用看家基因来完成均一化处理Sample1 Ct1(25) Sample2 Ct2(22)内参基因 actin Ct 01 20 Ct02 21CT1= Ct1-Ct01=25-20=5 CT2=Ct2-Ct02=22-21=1CT= CT1- CT2=5-1=4基因表达量Sample1/sample2=2- CT=2-4=1/16第四十一张，PPT共五十页，创作于2022

11、年6月SimpleComplex 2CT 假定目的基因与看家基因的 扩增效率都是100% 只有一个看家基因 Pfaffl Modification 考虑到扩增效率的影响 只有一个看家基因 Vandesompele Method 考虑到扩增效率的影响 有多个看家基因相对定量第四十二张，PPT共五十页，创作于2022年6月 利用相对标准曲线定量，定量结果相除得到倍数差别 同时建立两条标准曲线 一条目的基因的标准曲线 至少再做一条看家基因的标准曲线 借助标准曲线校准扩增效率的影响 使用标准曲线法进行相对定量分析相对定量标准曲线法 第四十三张，PPT共五十页，创作于2022年6月 进行可靠的定量实验需

12、要对引物对进行优化设计 用于优化扩增产物产量和特异性的参数 引物设计 扩增片段选择 试剂的浓度 循环条件 变性温度和退火温度PCR体系优化第四十四张，PPT共五十页，创作于2022年6月利用动态温度梯度功能一次实现退火温度的优化退火温度的优化第四十五张，PPT共五十页，创作于2022年6月45oC55oC65oC溶解曲线扩增曲线1. 95oC for 15 min2. 94oC for 10 sec3. Gradient from 45oC to 65oC for 15 sec4. 72oC for 30 sec5. 83oC for 1 sec6. Plate Read7. Go to li

13、ne 2 39 more times8. Melting curve from 65oC to 95oC, readevery 0.2oC, hold 1 sec.退火温度的优化第四十六张，PPT共五十页，创作于2022年6月实时荧光定量PCR应用定量： DNA定量 RNA定量定性： SNP分析 基因型分析 RNA变异分析 融解曲线分析 第四十七张，PPT共五十页，创作于2022年6月定量PCR应用I-实时定量 病原体定量检测 转基因拷贝数的检测DNA定量拷贝数研究（替代Southern Blot）RNA定量基因表达差异（替代Northern Blot) 单个或多个基因地表达谱分析 不同组织、器官 不同时期 不同处理第四十八张，PPT共五十页，创作于2022年6月定