荧光分光光度计

1、荧光的原理1 .荧光的定义：物质的发光随照射光停止而立即消失的叫荧光。荧光寿命：10-8-10-9秒 磷 光：10-4秒荧光的产生：光物质分子吸收能量激发到第一电子激发状态及其它电子激发态的各个能 级回到单线第一电子激发态的最低振动能级向基态各能级跃迁发光（荧光）。从此可见，任何能发荧光的物质都有两种特征光谱：激发光谱和吸收光谱，前者表示不同波 长的激发光产生荧光的效率，后者表示物质发射出不同波长光线的相对强度。荧光分光光度计是用于扫描液相荧光标记物所发出的荧光光谱的一种仪器。其能提供包括激发光谱、发射光谱以及荧光强度、量子产率、荧光寿命、荧光偏 振等许多物理参数，从各个角度反映了分子的成键和

2、结构情况。通过对这些参数 的测定，不但可以做一般的定量分析，而且还可以推断分子在各种环境下的构 象变化，从而阐明分子结构与功能之间的关系。荧光分光光度计的激发波长扫描 范围一般是190650nm，发射波长扫描范围是200800nm。可用于液体、固体样 品（如凝胶条）的光谱扫描。描述荧光的参数：荧光寿命：去除激发光后，荧光强度降到激发时最大强度的e-1需要的时间。荧光效率：即发射量子数与吸收量子数之比。中=发射量子数/吸收量子数荧光强度：F=KI0clz中F:荧光强度K:仪器常数I0:激发光强度C：样品物质L：样品池厚度Z：物质吸光系数中：荧光效率荧光分析的特点：高灵敏度：荧光分析的灵敏度比分光

3、光度计法大23个数量级。分光光度法通常在10-7级，而荧光的灵敏度达10-9。强选择性：荧光物质具有2种特征光谱：激发光谱和吸收光谱，分光光度法通过测定物 质的吸收光谱来分析，而荧光可根据激发光谱和发射光谱来鉴定物质。信息量丰富：能提供荧光物质的多种参数。不足之处：很多物质本身不发荧光；荧光的产生与化合物结构的关系不明确；干 扰因素多，光分解、氧淬灭、易污染。荧光分析的常用方法：直接测定法：利用物质本身发出的荧光来进行测定。因为大部分物质不发荧光，该法少 用。间接测定法：物质本身不发荧光，跟荧光探剂结合后转变成荧光物质进行测定。荧光探针探剂的条件：（1）探剂与被测物质分子的某一微区必须有特异性

4、结合且牢固；探剂的荧光必须对环境条件灵敏；结合的探剂不会影响被测物质的分子结构和特性；能利用荧光淬灭和光分解等对荧光进行有效定量和定性分析。影响荧光测量的几种因素：温度影响：一般说来，荧光随温度升高而强度减弱，温度升高1 C，荧光强度下降11 0%不等。测定时，温度必须保持恒定。PH值影响：PH值影响物质的荧光，应选择最佳PH制备样品。光分解对荧光测定的影响：荧光物质吸收紫外可见光后，发生光化学反应，导致荧光强度下降。因此，荧光分析仪要采 用高灵敏度的检测器，而不是用增强光源来提高灵敏度。测定时，用较窄的激发光部分的狭缝，以减弱激发光。同时，用较宽的发射狭缝引导荧光。荧光分析应尽量在暗环境中进

5、行。散射光的影响：主要是瑞利散射光和拉曼散射光的影响较大。校正办法：先用短的激发光激发，检出溶液的 拉曼峰，然后进行荧光光谱校正。因为荧光光谱不随激发光波长的改变而改变，而拉曼光却 随之改变。高浓度样品的影响：1）当激发光照射高浓度样品时，在激发光入口附近产生荧光，但这些荧光并不能进入荧光 检测器。2）高浓度的分子之间相互作用而发生活性阻碍现象。3）荧光的再吸收：即荧光光谱的短波长端和激发光谱的长波长端如果相互重叠，则发生荧 光再吸收。总之，高浓度样品进行荧光分析时，应进行稀释。荧光分析仪的基本结构：基本结构：激发光源、激发单色器、样品室、发射单色器及检测系统。荧光分析仪与紫外分光光度计的结构

6、主要区别有两点：1）检测器的检测方向，2）检测器前面有无单色器。1 .光源：1）汞灯：发射强度大、稳定、不需复杂电源，但谱线不连续，数目少。主要用于滤片荧光 计。2）氙灯：发出射线的强度大，谱线连续，分布于250700nm光域内，且在300400nm 波段内射线强度几乎相等。但该灯的电源功率要求大，且电源稳定，因此电源结构复杂。滤光片和单色器：1）滤光片：用于滤片荧光计中a.激发光滤片：放在光源和液槽和检测器之间，滤去不需要的光线；b.荧光滤片：放在液槽 和检测器之间，滤去反射光，瑞利散射光、拉曼光以及溶液杂质所发荧光等，让被测物发出 的荧光通过且照射到检测器上。2）单色器：光栅：是单色器的主

7、要元件。优点：a.对所有波长产生衍射，且谱线分布均匀，有相同的分 辨率。入射光80%的能量在一级光谱中。C.灵敏度高、便宜。缺点：有部分光栅谱干扰 分析，可加前置滤片加以消除。狭缝：是单色器的重要组成部分，直接影响到分辨率。狭缝宽度越小，单色性越好，但光强 度也随之减少。分辨率BP满足下列公式：BP= W/FDW:狭缝宽度F：焦距D：色散率样品池：常用玻璃和石英制成，有正方形和长方形两种。材料要求：不发荧光或低荧 光。检测器：主要有硒光电池、光电管和光电倍增管等。选择光电倍增管要考虑：响应波 长、灵敏度和噪声水平。蓝敏管对蛋白质、核酸的测量适用，而红敏管则适用于荧光染料检 测。荧光分光光度计F

8、-380F-380型荧光分光光度计是新开发的高端荧光光谱便产品结构新颖、价格适中、功能完善，完全适合科 研、医疗、化工、生化、环保以及临床检咧、食品检验等领域。主要饪点（1）F-380具有性能稳定，使用方便等特点。尖端光谱仗制造技术，便其拥有更杰出的性能。光学设计，也 提升了灵敏度等技术指标，也使仪器紧演，占用更小实验台面积。（2）内置的切光器功能可将样品在激发光束下的暴露时间缩貌至扫描时间的8%。样品暴熹时间的缩窸 可 保护容易发生光反应的样品，提高延续性实验的分析精度。磷光分析可测星貌达1吨的磷光寿命，并可以应 用于各种样品类型。1 3）除荧光和璘光外，标准配置中还包括了发光侦定功能。系统

9、光能星通过能力强信噪比高，因而可对 化学发光和生物发光进行有效测定o（4）自动预扫描能帮助您找到最忧的荧光分析条件可以快速探知未知样品的光谱信息，同时完全避免将 其他散射光谱峰错误设定为荧光激发或荧光发射峰。（5）基于Microsoft Windows的控制及分析软件，简洁易用，使您轻松进行参数设置、数据采集和数据进 理.同时提供更多三雄谱图计耸功能，以及提供方便的数据输出和用户可自由设计地报告格式。（6）采用呢鸵.口接口，数据传输速度快，连接方便。（T）高强度的1如瓦氟灯，200-900iun波长范围内的测定提供充足的光能。（8 ）独特的水平狭缝设计同时应用于激发和发射光束，有效提高了灵逾度

10、。同时在标准的1口响比色皿，只 要口.况1样品就可进行正常测定。（9）系统有更丰富的定星分析功能。重复标样测定功能提供了最精确的工作曲践 统计校验进一步保证了 分析精度。（如）为了最大程度地保证稳定 F-380拥有激发光束配比监测系统，可监测不同波长下光源强度的微小 变化。（11）多样有用的附件，从固体样品支架到自动偏振附件，F-380郡可以配备，协助您解决最困范的应用分 析问题。（12）维光谱图在1分钟内即可完成，提供最丰富的光谱信息，等高线图和鸟瞰图给魅多个观察的角度。便三能谱圈的定性分析功能发挥极致o基本参教波长范围：200-760皿和零缀光C 200-900 run 选用特殊光电倍增管

11、毗明F ）；色散元件：采用凹面衍射光栅C闪耀波长：激发如口硕/发射知口皿）；带宽:EX： 1.0, 2. 5,5.0, 10.0mEM:l.Ci, Z.5, 5.CU 10.0 j 20.0 m ;接收器：E3花8光电倍增菅；光源：1SC幅灯；波长扫描速度：15 iun/min j 60 iun/min 240 mn/min j 1200 nm/min j 2400 lun/min j 12000 nm/min30000nm/min （ 500iun/i ）；工作温度：1A3DY ；工作湿度：70%；体积：680WX540DX320Hjnm;重量：48kg主要技术指标分辨率1 0 m；波长准确度：2.口皿；灵做度：比口 ： 1水拉星峰（F-P）荧光计TBS-380荧光计规定使用什么规格的比色杯？TBS-380最合适的比色杯规格是10 x10 mm比色杯。