角膜整铺片免疫荧光染色protocol

1、角膜整铺片免疫荧光染色protocol实验器材：手术显微镜（Topcon OMS-90）, 4C冰箱角膜剪1把，无齿显微镊2把，90mm玻璃平皿，11#手术刀片2个，1.5mlEP管，EP管架、 棉签，记号笔，移液器（规格1ml,100ul,10ul各一把，Gilson），无菌枪头（规格1ml,100ul,10ul）、 10ml无菌玻璃瓶和橡胶塞，50mL烧杯，一次性塑料吸管，封口膜，清洁载玻片，0.17um 清洁盖玻片，吸水滤纸，避光片盒、记录纸笔。实验试剂：1、D-PBS （Kcl 0.2g,KH2PO4 0.2g,Na2HPO4- 12H2O 2.8976g,Nacl 8g,D-Gluc

2、ose 1g 溶解于1000ml注射用水，调节PH7.2-7.4）2、TritonX-100（solarbio）（平常配制成 10%储备液，9mlD-PBS+1mlTritonX-100, 保存于4C冰箱，临用前用2%BSA稀释成0.2%Triton-BSA）3、BSA （Roche分装）（可配制成2%BSA溶液：称取2gBSA粉末溶解于 100mlD-PBS溶液内，完全溶解后分装至10ml玻璃瓶内，每瓶5ml，封口标记后冻存于-21C 备用，临用前溶解即可）4、固定液：4%多聚甲醛（称取4g多聚甲醛固体溶解于100mlD-PBS溶液内，60C 水浴促溶，完全溶解后封口标记，保存于4C冰箱备用

3、，2周内使用）后来张老师查资料， 不宜放置4C冰箱，否则会有析出，室温放置即可。使用之前4C预冷。AF固定液（95%乙醇90ml+甲醛原液10ml，易挥发，注意密封，保 存于4C冰箱备用，2周内使用）2%甲醛（甲醛原液浓度为37%-40%，用D-PBS将其稀释成2%，封 口标记，保存于4C冰箱，2周内使用）后来张老师查资料，不宜放置4C冰箱，否则会有 析出，室温放置即可。使用之前4C预冷。抗体染液：临用现配。冰盒上而操作，加之前反复吹打DAPI （invitrogen 10mg/ml， 用 D-PBS先将其稀释成100ug/ml的储备液，临用前 用D-PBS稀释成1ug/ml即可）CFW染液：

4、（FLUKA公司名，为10%CFW，临用前用D-PBS稀释成0.1%即可） 荧光封片胶（sigma）实验操作：1、准备实验器械和4C预冷的D-PBS和固定液，向1.5mlEP管内加满4C预冷的固定液， 向90mm的玻璃平皿内倒入4。预冷的D-PBS或固定液。2、取材：将小鼠脱颈椎处死，在手术显微镜下，暴露眼球，用刀片自靠近操作者的一侧沿 角膜缘稍偏下（以免角膜缘保留不全）的部位向前平行刺入，将眼球平切一半，再用角膜剪 剪取角膜，置于玻璃平皿内，左右眼放入不同的平皿内。剔除晶体、虹膜等非角膜组织，只 保留完整的角膜和角膜缘。（取材最好在冰上操作）8只，约2h可以将眼球固定在AF中过夜，在PBS中

5、修剪，之后修剪再放入PBS3、固定:用D-PBS冲洗角膜表面残留的血液或毛发后，将其置于盛有固定液的EP管内，4C， 固定30min-2h。（角膜放入EP管，务必保证角膜呈自然的“碗状”，否则，固定之后，角膜 硬度增加，切片时不易展平）4、冲洗：倒去EP管内的固定液，向EP管内加满4C预冷的D-PBS，快速冲洗一遍，再继 续用D-PBS冲洗5遍，每遍10min。（冲洗时，可轻轻颠倒EP管，使冲洗效果更佳；冲洗 时可将D-PBS倒入50mL小烧杯内，避免直接从玻璃瓶反复吸取，污染溶液）5、配制0.2%Triton-BSA，置于4C冰箱备用。取出冻存于-21C冰箱的2%BSA置于室温溶 解，溶解后

6、保存于4C冰箱。预先完成？ ？6、破膜：冲洗完毕，倒去EP管内的D-PBS，残留的D-PBS可用移液器吸掉，用1ml移液 器向管内加入200ul0.2%Triton-BSA，浸没角膜组织。将EP管置于4C冰箱，30min。7、封闭：破膜结束，倒去EP管内的0.2%Triton-BSA，用移液器吸取2%BSA溶液200ul加至EP管内浸没角膜组织。将EP管置于4C冰箱，30 min。8、配制抗体染液（常用抗体浓度及固定液见附1）9、抗体孵育：更换EP管并做好相应标记，向每个EP管内加入50ul抗体染液，用锡箔纸 包裹EP管，再用无齿显微镊将角膜组织从原来的EP管中取出置于新的有相应标记的EP 管

7、内。确保角膜浸于抗体染液中。将EP管置于4C冰箱，过一夜（按12h计算）。.明天操作10、冲洗：更换EP管，向新的EP管内加满D-PBS并做好相应标记，用锡箔纸包裹EP管， 用无齿显微镊将角膜组织从抗体染液中取出置于D-PBS溶液中，轻轻颠倒EP管，快速冲洗 一遍，继续用D-PBS冲洗5遍，每遍10min。（将抗体染液保存于4C冰箱，有些抗体可以 重复使用）11、配制0.1%CFW染液。12、CFW染色：冲洗完毕，倒去D-PBS溶液，向EP管内加入100ul 0.1%CFW染液，室温， 染色10min。13、冲洗：同步骤4。弃CFW14、配制 1ug/ml DAPIo15、DAPI复染：冲洗完

8、毕，倒去D-PBS，向EP管内加入50ul 1ug/ml DAPI染液，4。，染 色 30min.。16、冲洗：同步骤4。弃DAPI17、整铺片：取出角膜，置于清洁载玻片（载玻片，有磨砂面向上）上，在角膜组织上滴- 滴D-PBS溶液，使角膜不易粘连，易维持自然舒张状态。用无齿显微镊协助使角膜上皮面 向上，用刀片将角膜切成4瓣，但使角膜中央相连接，轻轻展平角膜组织，用吸水滤纸吸掉 角膜周围多余的水分，但不能使角膜干掉。滴一滴封片胶，从一端轻轻盖上盖玻片。将片子 置于干燥避光处保存，待封片胶晾干用塑料袋包裹片盒再置于4C冰箱保存，长时间保存可 置于-21C附1：实验室常用抗体抗体名称公司固定液常用浓度PE CD31 （血管）eBioscienceAF300ul 0.2%Triton-BSA+5ulFITC Gr-1 （中性粒）eBioscienceAF300ul 0.2%Triton-BSA+3ulPE CD3eeBioscienceAF300ul 0.2%Triton-BSA+6ulFITC CD80李志杰教授提供AF600ul0.2%Triton-BSA+0.1ulPE yT）eBioscienceAF300ul 0.2%Triton-BSA+6ulPE CD41eBioscience2%甲醛300ul 0.2%Triton-BSA+6ulAlexa fl