荧光原位杂交实验具体步骤及详细说明

1、荧光原位杂交实验具体步骤及详细说明用已知的标记单链核酸为探针，按照碱基互补的原则，与待检材料中未知 的单链核酸进行异性结合，形成可被检测的杂交双链核酸。由于DNA分子在 染色体上是沿着染色体纵轴呈线性排列，因而可以探针直接与染色体进行杂交 从而将特定的基因在染色体上定位。探针变性将探针在75C恒温水浴中温育5 min，立即置0C,5 10 min，使双链 DNA探针变性。标本变性(1)将制备好的染色体玻片标本于50C培养箱中烤片23 h(经Giemsa 染色的标本需预先在固定液中退色后再烤片)。(2 )取出玻片标本，将其浸在70 75C的体积分数70%甲酰胺/2x SSC的 变性液中变性23

2、min。(3)立即按顺序将标本经体积分数70%、体积分数90%和体积分数100%冰 乙醇系列脱水，每次5 min,然后空气干燥。杂交将已变性或预退火的DNA探针10 uL滴于已变性并脱水的玻片标本上，盖上18x18盖玻片，用Parafilm封片，置于潮湿暗盒中37C杂交过夜(约15 17h)。由于杂交液较少，而且杂交温度较高，持续时间又长，因此为了保持标本的湿润状态，此过程在湿盒中进行。洗脱此步骤有助于除去非特异性结合的探针，从而降低本底。(1)杂交次日，将标本从37C温箱中取出，用刀片轻轻将盖玻片揭掉。(2 )将已杂交的玻片标本放置于已预热42 50C的体积分数50%甲酰胺/2xSSC中洗涤

3、3次，每次5 min。(3)在已预热42 50C的1xSSC中洗涤3次，每次5 min。(4 )在室温下，将玻片标本于2xSSC中轻洗一下。取出玻片，自然干燥。取200 uL复染溶液(PI/antifade或DAPI/antifade染液)滴加在玻片标本上，盖上盖玻片。杂交信号的放大(适用于使用生物素标记的探针)(1)在玻片的杂交部位加150 uL封闭液I,用保鲜膜覆盖，37C温育 20min。(2 )去掉保鲜膜，再加150 uL avidin-FITC于标本上，用保鲜膜覆盖，37C 继续温育40 min。(3)取出标本，将其放入已预热42 50C的洗脱液中洗涤3次，每次5 min。(4 )在

4、玻片标本的杂交部位加150 uL封闭液II,覆盖保鲜膜，37C温育20 min。(5)去掉保鲜膜，加150 uL antiavidin于标本上，覆盖新的保鲜膜，37C 温育40 min。(6 )取出标本，将其放入已预热42 50C的新洗脱液中，洗涤3次，每次5 min。（7）重复步骤（1）、（2）、（3），再于2xSSC中室温清洗一下。（8）取出玻片，自然干燥。（9）取200 uL PI/antifade染液滴加在玻片标本上，盖上盖玻片。封片可采用不同类型的封片液。如果封片液中不含有Mowiol （可使封片液产生自 封闭作用），为防止盖片与载片之间的溶液挥发，可使用指甲油将盖片周围封 闭。封好

5、的玻片标本可以在-20 -701的冰箱中的暗盒中保持数月之久。荧光显微镜观察FISH结果先在可见光源下找到具有细胞分裂相的视野，然后打开荧光激发光源，FITC的 激发波长为490 nm。细胞被PI染成红色，而经FITC标记的探针所在的位置 发出绿色荧光。所用不同荧光材料的激发光和发射光波长及滤光镜选择芒花麝靠1耦费波怏伊时）箕射谀栈俱拍）液用谐腹光FITC520IBrhodamine51157280Texas Red洒技0IVS15570U5455UPI汕615: 癌名9|注意事项相关溶液的配制1.20 xSSC : 175.3 g NaCl , 88.2 g 柠檬酸钠，加水至 1 000 m

6、L（用 10 mol/L NaOH 调 pH 至7.0）。去离子甲酰胺（DF）:将10 g混合床离子交换树脂加入100 mL甲酰胺 中。电磁搅拌30 min，用Whatman l号滤纸滤。体积分数70%甲酰胺/2xSSC : 35 mL甲酰胺，5 mL 20 xSSC, 10 mL水。体积分数 50%甲酰胺/2xSSC : 100 mL 甲酰胺，20 mL 20 xSSC , 80 mL 水。体积分数50%硫酸葡聚糖（DS）:65C水浴中融化，4C或-20C保存。杂交液：8 体积分数25%DS , 20 pL 20 xSSC混合。（或40 体积分 数 50% DS , 20 pL 20 xSS

7、C , 40 pL ddH2O 混合）取上述混合液 50 pL, 与5 pL DF混合即成。其终浓度为体积分数10% DS , 2xSSC，体积分数 50% DF。PI/antifade 溶液PI原液：先以双蒸水配置溶液，浓度为100 pg/mL，取出1 mL,加39 mL 双蒸水，使终浓度为2.5 pg/mL。Antifade原液：以PBS缓冲液配制该溶 液，使其浓度为10 mg/mL，用 0.5 mmol/L的NaHCO3调pH值为8.0。取 上述溶液1 mL,加9 mL甘油，混匀。PI/antifade溶液：PI与antifade原液按体积比1:9比例充分混匀，20C 保存备用。DAPI

8、/antifade溶液：用去离子水配制1mL/mg DAP I储存液，按体积比 1:300，以antifade溶液稀释成工作液。封闭液 I：体积分数 5% BSA 3 mL, 20 xSSC 1 mL,ddH2O 1mL ,Tween20 5 pL 混合。L , ddH2O 750 pL, Tween20 5 pL 混合。荧光检测试剂稀释液：体积分数5% BSA 1mL, 20 xSSC 1mL,ddH2O 3mL , Tween20 5pL 混合。洗脱液：100 mL 20 xSSC ,加水至 500 mL,加 Tween20 500 pL。相关溶液的配制1.20 xSSC: 175.3 g

9、 NaCI , 88.2 g 柠檬酸钠，加水至 1 000 mL （用 10 moI/L NaOH 调 pH 至7.0）。去离子甲酰胺（DF）:将10 g混合床离子交换树脂加入100 mL甲酰胺 中。电磁搅拌30 min，用Whatman I号滤纸滤。体积分数70%甲酰胺/2xSSC: 35 mL甲酰胺，5 mL 20 xSSC, 10 mL水。体积分数 50%甲酰胺/2xSSC:100 mL 甲酰胺，20 mL 20 xSSC, 80 mL 水。体积分数50%硫酸葡聚糖（DS）:65C水浴中融化，4C或-20C保存。杂交液：8 体积分数25%DS,20 pL 20 xSSC混合。（或40 体

10、积分 数 50% DS ,20 pL 20 xSSC,40 pL ddH2O 混合）取上述混合液 50 pL,与5 pL DF混合即成。其终浓度为体积分数10% DS,2xSSC,体积分数50% DF。PI/antifade 溶液PI原液：先以双蒸水配置溶液，浓度为100 pg/mL，取出1 mL,加39 mL双 蒸水，使终浓度为2.5 pg/mL。Antifade原液：以PBS缓冲液配制该溶液， 使其浓度为10 mg/mL，用 0.5 mmol/L的NaHCO3调pH值为8.0。取上述 溶液1 mL,加9 mL甘油，混匀。PI/antifade溶液：PI与antifade原液按体积比1:9比

11、例充分混匀，20C 保存备用。DAPI/antifade溶液：用去离子水配制1mL/mg DAP I储存液，按体积比 1:300，以antifade溶液稀释成工作液。封闭液 I：体积分数 5% BSA 3 mL,20 xSSC 1 mL,ddH2O 1mL ,Tween20 5 pL 混合。封闭液 II :体积分数 5% BSA 3mL,20 xSSC 1mL, goat serum 250pL,ddH2O 750 pL,Tween20 5 |jL 混合。荧光检测试剂稀释液：体积分数5% BSA 1mL,20 xSSC 1mL, ddH2O 3mL ,Tween20 5混合。洗脱液：100 mL 20 xSSC,加水至 500 mL ,加 Tween20 500 pLo荧光原位杂交(Fluorescence in situ hybridization FISH )是一门新兴的分子 细胞遗传学技术，是20世纪80年代末