细胞损伤模型

1、细胞损伤模型一、体外肝细胞损伤模型建立（CC14和H2O2）hiIII1大鼠肝细胞的分离和培养 大鼠4%戊巴比 妥麻醉，门静脉插管，先以无钙灌流液灌流，继 以37X通入O2的W型胶原酶灌流液继续循环 灌流15 min。将肝脏移至一平皿内，轻轻撕去 肝包膜后，加入含5%小牛血清的清洗液，用吸 管吹打成单个肝细胞悬液，200目尼龙网过滤， 低速离心（500 min-1，1 min，4C）弃 上清，同法用清洗液反复洗3次。然后用完全 1640培养液（内含 10 %小牛血清，105 U-L-1青霉素，100 mg-L-1链霉素和10 mgL-1胰岛素）制成1X109 个L-1肝细胞 悬液。分离的肝细胞

2、经06%台盼蓝拒染法测得 细胞活力大于90%，高碘酸雪夫反应显示糖原 法鉴定99%为肝实质细胞。将上述肝细胞悬液分别加入24孔（每孔1 ml） 和96孔（每孔0.1 ml）培养板中，置37X, 5%CO2培养箱中培养。1216 h后可见肝 细胞贴壁于培养板孔底上生长。2 CC14诱导肝细胞坏死性损伤模型的建立 肝细胞培养12 h后，吸弃上清，更换培养液并 加入不同浓度的CCl4 ( 116 mmol-L-1)，以少量的二甲亚砜助溶，二甲亚 砜终浓度为01% (体积分数)，作用不同时间 (112 h)后，收集24孔板中培养上清检测l=JAST，以及肝细胞的MDA含量和GSHpx活 性；同步测定9

3、6孔板中培养肝细胞的MTT反 应。根据检测结果制备CC14诱导肝细胞损伤的 量效和时效曲线。选择最造损伤浓度和损伤时间 制备肝细胞的损伤模型，同时设溶媒对照组，每 组至少设3个复孔。3 H2O2诱导肝细胞坏死性损伤模型的建立 同法更换培养液，加入不同浓度的H2O2(0.23.2 mmol-L-1),作用不同时间=)(0.54 h)后，收集24孔板中培养上清检 测ALT,测定肝细胞的MDA含量；同步测定 96孔板中培养肝细胞的MTT反应。根据检测 结果制备H2O2诱导肝细胞损伤的量效和时效 曲线，选择最适损伤浓度和损伤时间制备肝细胞 的损伤模型，同时设溶媒对照组，每组至少设3个复孔。4检测指标（

4、1）AST、ALT的测定 培养的肝细胞经离 心（1 800 rmin-1, 10 min）后收集上清， 按试剂盒说明书步骤测定上清液中 AST和 （或）ALT活性，结果以U（106 cell）-1表示。（2）肝细胞增殖试验 采用MTT比色法。（3）肝细胞谷胱甘肽过氧化物酶（GSHpx） 活性的测定 先制备GSH标准曲线。弃肝细胞 培养上清，加入02 % Triton-100水溶液 0.5 ml，混匀，2 min 后，离心（2 500 r-min-1, 10 min），取上清液（肝细胞样品） 0.4 ml，另设样品空白管，非酶反应管和试剂 空白管，加入各种试剂。混匀后立即计时，静置 12 min

5、后，以样品空白管调零点，于423 nm 波长处读得吸光度（A）值。在GSH标准曲线 上查出对应的GSH波度。GSHpx酶活力单位 是在37C，pH6.5条件下，每106个肝细胞、每分钟使GSH浓度下降1 pmol为1个酶活 力单位。计算公式为： GSHpx活力单位= （GSH非酶管-GSH样品管-GSH试剂空白管）/3。结果以U（106 cell）-1表 示。l=J11（4）肝细胞丙二醛（MDA）含量的测定 先 制备MDA标准曲线。弃肝细胞培养上清，加入 生理盐水1 ml,混匀，移入离心管中，离心（2 500 min-1，10 min），弃上清，加 15% TCA 2 ml，破坏细胞并沉淀蛋白

6、质，加入 0.67 % TBA 2 ml，于沸水浴中加热 30 min。根据样本的吸光度值在标准曲线上查出对 应的浓度，结果以nmol-（106 cell）-1表示。l=J1=1（5）数据处理 数据以s表示，计量资料 组间比较采用t检验。两变量间相互关系，采用 直线相关和回归分析。二、体内肝损伤模型（酒精）1、材料 纯系SD雄性大鼠，体重180g200g,由浙江大学医学院实验动物中心提供。食用酒精选用北京酿酒总厂出品的56度红星二锅 头。2、方法 将大鼠随机分成5组,饲养在237 25C室内，自由进食、进水；根据大鼠体重， A、B、C、D组每日用56红星二锅头白酒以 10ml/1Kg分别灌胃0

7、、4周、8周和12周； E组于酒精灌胃12周后，停止灌胃4周。大鼠 通过股动脉采血处死，收集血浆和肝脏标本。3、主要指标检测肝功能：应用日立7170自动生化分析仪 测定总蛋白(TP)、白蛋白(Alb)、球蛋白(Glb)、 丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天冬氨酸氨基转移 酶(AST)等。氧化抗氧化物质测定：采用南京建成生物 工程研究所提供的试剂盒分别检测丙二醛 (MDA)、谷胱甘肽过氧化酶(GSH-Px)、谷 胱甘肽(GSH)、超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽-S-转移酶（GST）。（3）大鼠肝脏病理检查：大鼠处死后立即取出 肝脏，称重后一部分以10%的福尔马林液固定 作病理，作常规石蜡切块并H

8、E染色，在光学显 微镜下进行观察，用半定量法分别判定脂肪变 性、及酒精性肝炎炎症活动度 三、四氯化碳体外损伤肝细胞模型原代培养的正常大鼠肝细胞培养24h （贴壁良 好）后，置培养皿于一密闭的塑料盒，内置四氯 化碳04M容积，37度90min，造成肝细胞 损伤的模型，后转入正常培养，进行下一步实验。 （即熏蒸法）肝细胞培养12h后，吸弃上清，更换培养液并 加入CCL4 8mM （事先用 DMSO溶解，DMSO终浓度1 %），作用6h后收集24孔板 中培养上清检测AST以及肝细胞MDA含量盒 GSHpx活性，评价损伤程度。（常用方法）四、醋氨酚体外损伤肝细胞模型 肝细胞培养24h后，用清洗液洗2次

9、，培养液 洗1次，然后换以20mM醋氨酚的培养液，继 续培养12h，取培养液，进行下一步实验。五、过氧化氢体外损伤肝细胞模型肝细胞培养24h后，吸弃上清液，更换培养液 并加入H2O2 0.6mM，作用1h后，收集24 孔板中的培养上清液检测AST活性和MDA含六、氤化钾缺氧肝细胞损伤模型肝细胞培养24h后，贴壁生长良好的肝细胞中 培养液上清中LDH活性，以及酶的活性反应肝 细胞损伤程度。本模型可以更好的模拟缺氧损 伤。加入氤化钾2.5mM，继续培养2h，定量检测1=1七、硫代乙酰胺（TTA）体外肝细胞损伤模型肝细胞预培养24h后，贴壁生长良好的肝细胞 中加入TTA0.18mM，继续培养48h，

10、肝细 胞大量损伤和坏死，上清液中乳酸脱氢酶 （LDH）活性升高，造成体外损伤肝细胞模型。八、内毒素体外损伤肝细胞模型 贴壁生长良好的肝细胞中加入内毒素 70uL/mL，置 37度，5%CO2培养此时上 清LDH活性升高造成肝细胞损伤模型，造成体 外肝细胞损伤模型。九、半乳糖胺（GalN）体外损伤模型 分离肝细胞，预培养12-24h后，待细胞贴壁 生长均匀后，加入5mMGalN的肝细胞培养液， 继续培养1.5h，测定培养上清液中ALT，ALT 显著升高时，肝细胞造模成功。十、帕金森体外模型体外培养的中脑多巴胺能神经元MPTP损伤模 型HDIBIIIl实验操作：实验采用胚胎龄14 一 16天的大

11、鼠，剖子宫取胎，取胎鼠中脑腹侧区。可将多个 胚胎来源的组织收集在一起，置 F12培养基 (Gibco)至35mm的培养皿中，以细剪刀剪 碎。将2ml含0.125%的胰酶的F12加入到 组织中，该混合物于37C孵育10分钟后，加 入 DNase I(Sigma)至终浓度 80ng / m1， 继续于37oC孵育10分钟。消化后的组织以 尖端被火抛光的移液管轻轻吹打8次。该细胞 悬液以种植培养基稀释(种植培养基：MEM， 补充以2mm谷氨酰胺，6mg/ml葡萄糖， 1mg / ml谷胱甘肽，10 units / ml青霉素， 10ul/ml链霉素和7.5%胎牛血清)。细胞然 后种植于35mm 的预

12、先以10ug / m1 po1y1ysine (Sigma )和 2.5ug / ml merosin (Chemicon)铺底的培养皿中，种 植密度为50,000细胞/ cm2。培养16小时 后，培养基换为无血清培养基。该培养基为F12 和 basa1Eag1es medium，补充以 33mM葡萄糖，2mM谷氨酰胺，15 mM碳酸氢钠, 10mM HEPES (pH7.0)，lug / ml 谷胱甘 肽，20ug/ml胰岛素，100ug/ml转铁蛋 白，60uM腐胺，20nM孕酮，20nM亚硒 酸钠(NaSe)，30nM三碘甲状腺原氨酸，0.5 unit/ml青霉素和0.5mg/ml链霉素

13、。毒物处理：于第4天以1UMMP+处理48小 时。然后进行分析。=i模型评价：倒置显微镜下观察细胞形态、细胞计 数、免疫组化检测TH阳性细胞的数目和形态。体外培养的中脑多巴胺能神经元6-OHDA损 伤模型IfilliJ采用上述方法选择胎鼠，分离中脑腹侧部，解剖 显微镜下仔细剔除脑膜和血管，用高糖T-BSS 反复冲洗涤之七遍。并将组织剪碎，移入025% 胰蛋白酶溶液中，37oC振荡消化30分钟，后 加入血清数滴终止消化，用吸管轻轻吹打后，加 入不含血清的DMEM培养液混匀，1000rpm, 10min离心收集细胞，反复2次,后加入含血清的完全DMEM培养液悬浮细胞， 过220目不锈钢筛网使成单细

14、胞悬液，计数后 将约3X106个细胞接种人事先涂有多聚赖氨 酸的35mm的六孔培养板中，置37oC、5%CO2培养箱中培养。24小时后待细胞完全贴壁时，置换旧培养液，以后每隔2天更换一次 培养液。培养至第六天时加入100uM的 6-OHDA处理3小时后吸出。在相应备孔中加入完全DMEM培养液洗涤2遍，再加入完全liiiJDMEM培养液继续置5%CO2培养箱中培养 24小时，采用与上述相同的方法做免疫细胞化学染色，计数TH阳性细胞，确立6-OHDA对 体外培养的多已胺能神经元的损伤作用。十一、AB损伤模型取出生1-2d的乳鼠，用麻醉剂处死。在 D-hanks液中取大脑并分离海马组织，胰蛋白 酶消

15、化，获得细胞悬液，胎盘蓝染色进行死活细 胞记数，将细胞以5x105/ml的密度接种于 预先经L-多聚赖氨酸处理的96孔和24孔培养板，其中24孔板中预先放置有盖玻片。细胞 维持在培养液中，置入5%CO2,饱和湿度的 培养箱中培养，24h后全换液，接种当天为第 一天，每3d半量更换培养液一次，培养第3天 时加入阿糖胞昔,终浓度为10pmol/ L,以抑 制神经胶质细胞的过度增殖，24 h后更换全部 培养液继续培养，第10天进行细胞造模，开始 实验。也可以用PC12细胞株，常规培养Ap产物诱导海马神经细胞，建立细胞模型：选择A P25-35片段，用三蒸水配制成 100pmol? L -1,过滤,分

16、装厂20C冻存;使用前老化处理并配制成所需浓度。（将A P25-35溶解在DMSO中，在用DMEM稀释， 置于37C下孵育7-14天，即为老化状态）。细胞模型建立:加入浓度为20?mol/L的AP25-35,接触24h,诱导建立AD细胞模型.检测指标:MTT LDH凋亡细胞内钙离子 以及SOD等 十二、抑郁症的体外模型 抑郁等精神疾患的发生可能与过量GC对海马 的选择性损伤有关，但机理不明,Heuser和 Cosi等报道可能是由于高浓度GC导致神经营 养因子表达水平降低造成的，而抗抑郁剂不仅使 GC受体上调,HPA轴反馈恢复正常，而且使神 经营养因子表达升高，达到治疗目的.PC12细 胞株为大

17、鼠嗜铬细胞克隆化细胞株,分化的 PC12细胞有典型的神经细胞特征，其胞膜上 GC受体表达丰富6.本文根据文献方法以高 浓度皮质酮（corticosterone）模拟抑郁及焦 虑症神经细胞损伤状态 实验操作（MTT法测定细胞存活力）嗜铬细胞瘤株PC12细胞.用含5%胎牛血清及 5%马血清的DMEM培养基（含青霉素钠 200kU.L-1，链霉素 100mgL-1pH74）调ili-JIII=J细胞密度为2X108L-1接种于预先用多聚赖氨 酸（0.1g.L-1）处理过的96孔培养板,每孔 10LL,放入CO2孵箱，培养34d,待细胞长满 孔底后即可用于实验.参照文献方法,稍加修改, 吸去细胞液换上

18、含有相应浓度药物及 皮质酮的无血清DMEM（对照 组不含任何药品）,培养48h,吸去培养液，用 D2Hanks液洗 2 遍，每孔加入含 0.5g#L-1MTT的无血清DMEM培养4h后 吸去培养液，每孔加入10%十二烷基硫酸钠 100LL,待蓝色颗粒完全溶解（约1216h）, 用多孔扫描分光光度计测定标本在570nm波 长处的吸光度（A570nm）值，用于定量反映活 细胞数.十三、125I-UdR致C6胶质瘤细胞损伤的模 型1、材料：125I-UdR购自中科院北京原子能 所，放化纯度95%。脱氧腺苷（AdR）、脱 氧鸟苷（GdR）、脱氧胞苷（CdR）、脱氧尿苷 （UdR）均为Sigma公司产品

19、。2、方法（1）细胞培养：当癌细胞贴壁生长超过瓶壁的 70%，用胰蛋白酶消化30-40S，传代培养。 肿瘤细胞每3-4d传代1次。在50ml培养瓶 中，细胞数达2X106个细胞后，取处于对数 生长期的细胞进行细胞存活实验。（2）细胞存活实验:将制备好的细胞按1X105 个/ml细胞接种于25ml的培养瓶中，培养20 小时，实验组加入125I-UdR74KBq/ml及 不同浓度的 AUCG（10pM 20pM、30pM、 50M、80pM）再共同孵育24h后，100倍 的倒置显微镜下观察细胞形态，收集细胞，制成 单细胞悬液，调整细胞密度，接种于25ml的 培养瓶中，2-3d后换液，8-9d后细胞

20、集落形 成，每个剂量点设复瓶4瓶，同时设对照组未 加AUCG，另设空白组，均为4个复瓶。计算 细胞存活分数，绘制细胞存活曲线。3、检测方法(1)采用TEM技术观察凋亡细胞超微结构： 上述细胞用3%戊二醛固定后，PBS漂洗，1% 锇酸固定1h，经包埋处理，超薄切片，在透射 电镜(TEM)下观察细胞超微结构。=111(2)琼脂糖凝胶电泳成像：收集加入 125I-UdR74KBq/ml+AUCG30pM 后培 养24h的C6细胞2X105个，2500rpm离 心5min，去上清，加入裂解液，重悬细胞后， 再加蛋白酶K消化30min，用等体积的平衡酚 抽提两次，加入2倍体积的冰乙醇置-20C2h， 离

21、心去上清，以75%的冰乙醇洗涤两次后，加 双蒸水溶解DNA，取8pl DNA溶液及上样缓 冲液2pl上样稀释，用1.5%的琼脂糖凝胶， 电泳40min，将凝胶板在紫外光下，观察照相。流式细胞分析 十四、内皮细胞损伤模型1、细胞因子损伤模型将内皮细胞铺板后待即将单层融合时，换无血清 或低血清培养基，加入细胞因子如IL-2, TNFalpha、IFN等，共同孵育一段时间，或者 加入药物与之共孵育，或者加细胞因子之前先加 入药物孵育后，再加细胞因子，结束后测一些指 标如MTT、LDH、NO、等等看药物对细胞因 子损伤的保护作用。也可采用不同的时间、不同 的浓度来观察。2、缺氧一再供氧损伤模型也是先将

22、内皮细胞铺板后待即将单层融合时，换 和5%的CO2的混合气的缺氧槽环境中注意保 持37度的温度，用耗氧仪持续监测缺氧槽中的 氧分压，使之保持在0.5 KP左右，细胞在低氧 环境中培养一段时间后在移入正常的培养环境， 可观察不同的缺氧时间、不同的给氧时间对内皮 细胞形态功能的影响，也可结合药物观察，入上 所述。无血清或低血清培养基，先将细胞置于95%N2hihi此外，内皮细胞的损伤模型尚有双氧水损伤模 型、氧自由基损伤模型、氧化型脂蛋白损伤模型、 等等。最后提及一点，楼上说的ox-LDL损伤 模型的浓度不是很准确，因为从目前国内外的文 献来看，oxLDL( 10-50ug/ml)的浓度一 般不会

23、损伤内皮细胞尤其是内皮细胞系，如 ECV304，恰恰相反，的浓度的ox-LDL会促 进细胞的增值，国内有人报道，ox-LDL造成 ECV304 凋亡的浓度一般为 150ug/ml200ug/ml,也有用 100g/ml 的。十五、神经胶质细胞的制备和培养取新生一周内大鼠，碘酒、酒精浸泡消毒后 快速断头；IID用眼科剪和镊剪除皮肤和颅骨，分离皮肤和 颅骨时用不同的器具，弯剪剪取部分大脑皮层至 60mm培养皿，培养皿内提前放置D-Hanks 溶液；3）解剖镜下取出脑膜及血管，转移组织至另一盛有D-Hanks溶液的器皿，将组织剪碎为 1mm3左右的小块，然后小心转移至带螺帽的 离心管内；hi4）0.125%胰酶消化15-30分钟，以含10% 胎（小）牛血清的DMEM培养基终止消化，巴 氏吸管吹打，100目筛网机械过滤，制备混合 细胞悬液；5）计数，调整细胞密度，根据需求按适当密度 种植于培养瓶或皿内；III6）放置于含5%CO2的37C恒温培养箱，3天后换液，去除死亡及未贴壁细胞，以后每4日换液一次； 7）约两周后当细胞基本铺满时可在培养液中加 用二丁酸环腺昔（dBcAMP，