临床免疫学与检验：第四章 单克隆抗体和基因工程抗体的制备技术

1、1第四章 单克隆抗体和基因工程抗体的制备技术2抗体制备技术的发展已经的三个阶段用纯化抗原免疫动物获得的血清多克隆抗体(polyclonal antibody, PcAb)为第一代抗体。用B细胞杂交瘤技术制备的单克隆抗体(monoclonal antibody, McAb)为第二代抗体。第三代为基因工程抗体(genetic engineering antibody)。上述抗体的制备方法与特点各不相同，本章将分别介绍。3单克隆抗体1975年Kohler和Milstein首先报道用细胞杂交技术使经绵羊红细胞（SRBC)免疫的小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合，建立起第一个B细胞杂交瘤细胞株，并成功地制得

2、抗SRBC的 单克隆抗体（monoclonal antibody,McAb)。McAb的理化性状高度均一，与抗原结合的特异性强。Kohler和Milstein于1984年获得诺贝尔医学奖。4第一节 杂交瘤技术的基本原理基本原理： 杂交瘤技术是利用肿瘤细胞容易体外培养和长期生存的特性，将分泌特异性抗体的B淋巴细胞与肿瘤细胞融合获得杂交瘤细胞，制备的杂交瘤细胞同时继承了B淋巴细胞和肿瘤细胞两者的性质，既能分泌特异性抗体，又能长期生存。这样，就可以方便地用杂交瘤细胞制备和生产大量的单克隆抗体。5一、杂交瘤技术脾细胞 HGPRT+ Ig+骨髓瘤细胞HGPRTIgHAT培养基杂交瘤细胞单克隆抗体McAb

3、Y Y Y Y Y6（一）亲本细胞的选择与融合 1致敏B细胞 2骨髓瘤细胞 3细胞融合 71致敏B细胞首先用抗原免疫BALB/C小鼠，使机体B细胞被激活成为具有分泌抗体能力的浆细胞。脾是B细胞聚集的重要场所，故致敏B细胞主要来源于脾脏。82小鼠骨髓瘤细胞 骨髓瘤细胞为B细胞系恶性肿瘤，能在体外 长期增殖并容易与B细胞融合。9用于杂交瘤技术的骨髓瘤细胞应符合的条件本身不分泌免疫球蛋白；为次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转化酶（hypoxanthine-guanine- phospheribosyl-transfer ase，HGPRT）或胸腺嘧啶激酶（thymidine- kinase，TK）缺陷的细胞

4、株；瘤细胞能与B细胞杂交形成稳定的杂交瘤细胞；与B细胞融合率高。10目前常用的骨髓瘤细胞株BALB/C小鼠骨髓瘤NS1细胞株SP2/0细胞株等。113细胞融合细胞融合（fusion）是制备单克隆抗体的中心环节。方法：物理方法（如电场诱导）、化学方法（如PEG）或生物学方法（如仙台病毒）等。最常用的助融剂是分子量为10002000道尔顿的PEG。12(二) 杂交瘤细胞的选择性培养杂交瘤细胞的筛选： 两种亲本细胞经PEG或其他方法处理后， 可融合成不同类型的融合体， 正常的脾细胞在培养基中存活仅57天，无需特别筛选，细胞的多聚体形式也容易死去。而未融合的瘤细胞则需进行特别的筛选去除。 要从中筛选出

5、真正的杂交瘤细胞， 必须进行选择性培养。目前，常用HAT培养基。 HAT培养基： H: hypoxanthine 次黄嘌呤 A: aminopterin 氨基蝶呤 T: thymidine 胸腺嘧啶脱氧核苷 13细胞合成DNA的途径：1. 生物合成的主要途径，即利用糖和氨基酸合成核苷酸，进而合成DNA，而叶酸拮抗物氨基喋呤可阻断该途径。2. 另一途径是应急途径，当叶酸代谢受阻断后，细胞通过次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转化酶( HGPRT )和胸腺嘧啶核苷激酶( TK )，催化核苷酸前体合成核苷酸，进而合成DNA。 根据以上原理研制常规筛选用的HAT选择培养基，可对杂交瘤细胞进行筛选。14细胞DNA生

6、物合成途径示意图糖+氨基酸 氨基喋呤(A) 次黄嘌呤(H) HMP 核苷酸 核苷酸前体 DNA TK 胸腺嘧啶(T) TMP HGPRT正常途径应急途径15用来融合的瘤细胞是经毒性培养基选择出来的缺乏HGPRT的细胞株，所以在HAT选择培养基中不能生长。只有杂交瘤细胞具有亲代双方的遗传特性，即既有骨髓瘤细胞在体外无限繁殖的生命力又有B细胞经辅助途径合成DNA的能力，故可在HAT培养基中长期存活并繁殖。16有限稀释与抗原特异性选择有限稀释法 是目前应用最广的一种克隆化方法。在动物免疫中，应选用高纯度的抗原。一种抗原往往有多个抗原决定簇，一个动物在受到抗原刺激以后产生的体液免疫应答，实质是众多B细

7、胞群的抗体分泌。 而针对一个目标抗原表位的B细胞只占极少部分。 由于细胞融合是一个随即的过程，在已经融合的细胞中有相当比例的无关细胞的融合体， 需经筛选去除。筛选的过程分两步：17阳性杂交瘤细胞的克隆化培养与冻存（1）融合细胞的抗体筛选（2）特异性抗体筛选 方法 将融合的细胞进行充分的稀释，使其分配到培养板的每一孔中的细胞数量在 0 到数个之间（ 30% 的孔为 0才能保证单个孔中最多至含1个细胞）， 培养后取上清以ELISA方法选出抗体高分泌的细胞； 这一过程习惯上称为Cloning ，即克隆化。将这些阳性细胞再进行克隆化，应用特异性抗原包被的 ELISA 方法找出针对目标抗原的抗体阳性细胞

8、株，增殖后进行冻存、体外培养或动物腹腔接种培养。18第二节 单克隆抗体制备技术19201. 抗原提纯与动物免疫如没有特殊的要求，一般选用68周龄的雌性BLAB/C小鼠。为获得分泌抗目标抗原抗体的B淋巴细胞，制备杂交瘤细胞必须免疫动物。 免疫方案应考虑抗原的性质和纯度、 免疫原性的强弱、 抗原的分子量和剂量、 免疫的途径、 次数及间隔时间、佐剂的应用及动物对该抗原的免疫应答等。 应能获得足量的致敏 B 淋巴细胞。末次免疫结束后34d， 分离脾细胞融合。212.骨髓细胞及饲养细胞的制备选择瘤细胞株最重要的一点是与待融合的B 细胞同源。Sp2/0-Ag14(Sp2/0)、 P3-NS-1-Ag4.1

9、 (NS-1)、P3-X63-Ag8.653(P3.653)是常用的小鼠骨髓瘤细胞。在体外培养条件下，细胞的生长依赖适当的细胞密度，因此，在培养融合细胞和细胞克隆化时，还需加入其他饲养细胞（feeder cell ) 常用的饲养细胞为小鼠的腹腔细胞。制备方法：用冷冻的果糖液注入小鼠腹腔，轻揉腹部数次，吸出后的液体中即含小鼠富强细胞。223. 细胞融合细胞融合是杂交瘤技术的中心环节，基本步骤是将两种细胞混合后加入 PEG 使细胞彼此融合。其后以培养液稀释 PEG，消除 PEG 的作用。将融合后的细胞适当稀释，分置培养板孔中培养。应注意：（1）细胞的比例 （2）反应时间 （3）培养液成分234.抗

10、体初筛与克隆化一般在细胞融合成功后2周，即可取培养上清液检测有无特异性抗体，常用的方法有ELISA法和RIA法等。一旦测得抗体阳性的培养孔，就必须立即进行克隆化，即从中分离出单个细胞进行培养，使之繁殖成为单一细胞系的群体。目前常用的克隆化方法是有限稀释法。 245.杂交瘤细胞株的保存、复苏 选出的阳性细胞株应及早冻存。冻存的温度越低越好，冻存于液氮的细胞株活性仅有轻微的降低，而冻存在一70冰箱则活性改变较快。细胞不同于菌种,冻存过程中需格外小心。 二甲亚枫(DMSO)是普遍应用的冻存保护剂。 冻存细胞复苏后的活性多在50%95%之间。 如果低于50%,则说明冻存复苏过程有问题。256.单克隆抗

11、体的批量生产大量生产单克隆抗体的方法主要分两种，一种为小鼠体内诱生法，另一种为体外增量培养法。目前制备单克隆抗体以体内诱生法为主。先向小鼠腹腔注射降植烷(pristane)等造成无菌性腹膜炎，1周后将杂交瘤细胞配制成1106个/ml悬液注入小鼠腹腔，12周后小鼠可产生明显腹水，收集腹水即可获得高浓度的单克隆抗体。267.单克隆抗体的纯化与鉴定单克隆抗体的纯化方法同多克隆抗体的纯化。腹水中特异性抗体的浓度较抗血清中的多克隆抗体高，纯化效果较好。按所要求的纯度不同采用相应的纯化方法。纯化方法： （1） 盐析、凝胶过滤和离子交换层析。 （2） 亲和层析法27单克隆抗体的鉴定包括：结合抗原的特异性、敏

12、感性 、亲和力等。方法：与多克隆抗血清类似。282930单克隆抗体在医学中的应用其主要用途如下:诊断各类病原体肿瘤特异性抗原和肿瘤 相关性抗原的检测检测淋巴细胞的表面标志机体微量成分的测定31第三节 基因工程抗体技术基因工程抗体又称重组抗体，是指应用DNA重组及蛋白工程技术对编码抗体的基因按不同的需要进行改造和装配，经导入适当的受体细胞后重新表达的抗体。目前基因工程抗体技术主要包括： 1）应用DNA重组和蛋白工程技术对已有的单抗进行改造，包括人源化抗体、小分子抗体、双价特异性抗体和抗体融合蛋白等的制备； 2）用抗体库技术筛选、克隆新的单抗。 32一、人源化抗体嵌合抗体改形抗体33（一）嵌合抗体

13、1抗体V区基因的克隆 2抗体C区的选择 3表达载体的构建 4嵌合抗体的表达 34（二）改形抗体 改形抗体（reshaped antibody，RAb）是应用基因工程技术在嵌合抗体基础上用人抗体可变区的骨架区序列取代鼠源单抗CDR(互补决定区)以外的骨架区序列，重新构成既有鼠源单抗的特异性又保持抗体亲和力的人源化抗体，该抗体对人体几乎无免疫原性。 1RAb的分子设计 2RAb的基因构建35二、小分子抗体小分子抗体指分子量较小但具有抗原结合功能的分子片段。优点：免疫原性低且分子量小，易于穿透血管或组织到靶细胞部位，可用于免疫治疗；可在大肠杆菌等原核细胞中表达，降低生产成本；不含FC段，不会与带有F

14、C段受体的细胞结合，副作用小；半衰期短，有利于中和并及时清除毒素。小分子抗体包括：抗原结合片段（Fab）、可变区片段（Fv）和单链抗体（single chain Fv，ScFv）等。36三、双特异性抗体双特异性抗体（bispecific antibody，BsAb）又称双功能抗体。它不同于天然抗体，其两个抗原结合部位具有不同的特异性，可以同时与两种不同特异性的抗原发生结合。BsAb可通过化学交联法或将两种杂交瘤细胞融合而制备，也可采用基因工程技术制备。37双特异性抗体包括化学交联BsAb细胞工程BsAb 基因工程BsAb38（一）化学交联BsAb分别分离纯化两种不同抗原的单抗，先使Ig解离后，

15、获得单价抗体，再使两种不同抗原特异性的单价抗体或其片段交联起来。具体制备方法因实验室而异。此法易致抗体失活，其产物亦难以保证均质性。39（二）细胞工程BsAb 是将两种分泌不同特异性单抗的杂交瘤细胞进行融合产生二次杂交瘤。但后者所分泌的并非均一产物，两套重链、轻链之间随机重新组合的形式可多达10种。可能仅分泌两种亲本单抗，而无BsAb形成，也可能既分泌亲本单抗又可分泌BsAb。BsAb在所有Ig形式中所占比例可为10%50%不等。 40（三）基因工程BsAb一般采用抗体分子片段，如ScFv或Fab等，经基因操作修饰后，或在体外组装成为BsAb，或直接导入受体细胞表达为分泌型的BsAb。41四、抗体融合蛋白抗体融合蛋白是指将抗体分子片段与其他蛋白融合所得到的产物。这种抗体融合蛋白具有多种生物学功能。例如将抗体Fab段或Fv与其他生物活性蛋白融合，就可将特定的生物学效应导向靶部位；将ScFv与某些细胞膜蛋白融合，则可形成嵌合受体，赋予特定细胞以结合抗原的能力；若将非抗体蛋白与抗体分子的Fc段融合，可改善其药代动力学特性，并可使某些生物学活性与抗体的生物学功能相联。42五、噬菌体抗体库技术抗体库技术是指用细菌克隆代替B细胞克隆来表达抗体谱。它的出现基于PCR技术的发展和大肠杆菌直接表达性抗体分子片段的成功以及噬菌体显示技术的问世。43