临床免疫学与检验：发光免疫技术

1、发光免疫技术Luminescence Immunoassay发光免疫技术(luminescence immunoassay, LIA)是将发光分析和免疫反应相结合而建立的一种新的免疫分析技术。这种方法不仅具有发光分析的高灵敏度和抗原抗体反应的高度特异性,而且还具有分离简便,可以实现自动化分析特点,使之成为医学、生物学研究领域中一种新的重要的免疫学分析手段。根据发光方式不同发光免疫技术主要分为：发光酶免疫分析化学发光免疫分析电化学发光免疫分析 发光与化学发光剂一、发光 一种物质由电子激发态回复到基态时，释放出的能量表现为光的发射，称为发光 (luminescence)。根据形成激发态分子的激发能

2、可将发光分为三种类型: 1.光照发光 2.生物发光 3.化学发光。1. 光照发光(photoluminescence)发光剂经短波长入射光照射后进入激发态，当回复至基态时发出较长波长的可见光 。电子e光子基态能级2. 生物发光(bioluminescence)典型例子为萤火虫发光。反应底物为萤火虫荧光素 (firefly luciferin)，在荧光素酶(luciferase)的催化下利用ATP产能，生成激发态的氧化萤火虫荧光素 (oxyluciferin)，后者在回复到基态时多余的能量以光子形式放出。反应式如下:3.化学发光(Chemiluminescence)化学发光是在常温下经化学反应所

3、产生的发射光。化学发光是一个多步骤的过程，其机制为某些化合物(发光剂或发光底物)可以利用一个化学反应产生的能量使其产物分子或反应中间态分子上升至电子激发态。当此产物分子或中间态分子衰退至基态时，以发射光子的形式释放能量(即发光)。 二 化学发光剂发光剂（luminescence reagent）是指在发光反应中参与能量转移并最终以发射光子的形式释放能量的化合物。根据上述发光特点可将发光剂分为荧光素、生物发光剂和化学发光剂三种。化学发光免疫技术中常用的化学发光剂或发光底物 酶促反应的发光底物 直接化学发光剂 电化学发光剂 1酶促反应的发光底物酶促反应的发光底物是指经酶的降解作用而发出光的一类发光

4、底物，目前化学发光酶免疫技术中常用的酶有辣根过氧化物酶（HRP）和碱性磷酸酶（ALP），相应发光底物为： HRP的发光底物 HRP的发光底物 (1) HRP的发光底物 常用的底物为鲁米诺或其衍生物和对-羟基苯乙酸。鲁米诺或其衍生物 鲁米诺的氧化反应在碱性缓冲液中进行，通常以0.1mol/L pH8.6 Tris缓冲液作底物液，发光反应式如下:对-羟基苯乙酸（HPA） 对-羟基苯乙酸（HPA）在H2O2存在下被HRP氧化成氧化二聚体（荧光物质），在350nm激发光作用下，发出450nm波长的荧光，可用荧光光度计测量。反应式如下：（2）ALP的发光底物常用的底物为3-（2-螺旋金刚烷-4-甲氧基-

5、4-甲基-4-（3-磷酸氧基）-苯基-1，2-二氧乙烷（AMPPD）和4-甲基伞形酮磷酸盐（4-MUP，荧光底物）。AMPPDAMPPD在碱性条件下，被ALP酶解生成相当稳定的AMP-D阴离子，其有2-30min的分解半衰期，发出波长为470nm的持续性光，在15min时其强度达到高峰，15 60min内光强度保持相对稳定。发光反应式如下：4-MUP4-MUP在ALP催化下生成4-甲基伞形酮，在360nm激发光的作用下，发出448nm的荧光，用荧光光度计进行测量。反应式如下：2直接化学发光剂这类发光剂不需酶的催化作用，只需改变溶液的pH等条件就能发光，如吖啶酯（acridinium, AE）在

6、含过氧化氢的稀碱溶液中即能发光,反应式如下:3.电化学发光剂是指通过在电极表面进行电化学反应而发出光的物质。化学发光剂三联吡啶钌Ru(bpy)32+（图19-1）和电子供体三丙胺（TPA）在阳性电极表面可同时失去一个电子而发生氧化反应。二价的Ru(bpy)32+被氧化成三价，成为强氧化剂，TPA失去电子后被氧化成阳离子自由基TPA+，它很不稳定，可自发地失去一个质子（H+），形成自由基TPA.，成为一种很强的还原剂，可将一个高能量的电子递给三价的Ru(bpy)33+使其形成激发态的Ru(bpy)32+.。3.电化学发光剂激发态的三联吡啶钌不稳定，很快发射出一个波长为620nm的光子，回复到基态

7、的三联吡啶钌。这一过程可在电极表面周而复始地进行，产生许多光子，使光信号增强 。图19-2 电化学发光原理图 图19-1 三联吡啶钌分子结构图三、化学发光剂标记物的制备化学发光剂标记物是将化学发光剂与抗体或抗原结合在一起的复合物，亦称发光标记物。其标记方法很多，大多是利用交联剂使化学发光剂与被标记物分子结构中的游离的氨基、羧基、硫氢基（-SH）、羟基等基团形成不可逆连接。如吖啶酯类化学发光剂常用N-羟基琥珀酰亚胺活化法，使蛋白质（抗体或抗原）分子中的羧基，通过N-羟基琥珀酰亚胺活化，再与发光剂的氨基偶联形成酰胺键的发光标记物。三联吡啶钌Ru(bpy)32+ N-羟基琥珀酰胺（NHS）可与蛋白质

8、、半抗原激素、核酸等多种化合物结合成化学发光剂标记物，故ECLIA检测的项目较广泛。发光酶免疫分析 原 理 技术要点 方法学评价一、原 理发光酶免疫分析（luminescence enzyme immunoasssay， LEIA）实际上属于酶免疫测 定中一种类型，只是最后一步酶促反应所用底物为发光剂，通过发光反应发出的光在特定仪器上进行测定。常用的标记酶有辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase, HRP）和碱性磷酸酶（alkaline phosphatase ,ALP）,根据酶促反应底物不同，可分为荧光酶免疫分析和化学发光酶免疫分析。荧光酶免疫分析就是利用理想的酶荧光底

9、物，经酶促反应生成稳定且高效的荧光物质，通过测定荧光强度进行定量。图19-3 荧光酶免疫分析（双抗体夹心法） 化学发光酶免疫分析就是利用酶对发光底物催化作用而直接发光，通过光强度的测定而直接进行定量。图21-4 化学发光酶免疫分析（双抗体夹心法） 二技术要点 发光酶免疫分析的技术要点：包括抗原抗体反应标记物游离部分和结合部分分离酶促发光反应及检测等三部分。（一）抗原抗体反应 抗原抗体反应模式主要有以下三类。1双抗体夹心法2双抗原夹心法3固相抗原竞争法1双抗体夹心法用固相抗体和酶标抗体与待测标本中相应抗原反应，生成固相抗体-抗原-酶标抗体复合物，经B/F分离，加入底物经酶促反应后发光，其发光量与

10、待测标本中抗原含量呈正比。2双抗原夹心法该法常用于抗体的检测，用固相抗原和酶标记抗原与待测标本中相应抗体反应，生成固相抗原-待测抗体-酶标抗原复合物，经B/F分离，在免疫复合物中加入底物进行酶促发光，其发光量与待测标本中抗体含量呈正比。3固相抗原竞争法该法常用于多肽类小分子抗原的测定，用已知固相抗原和待测标本的相应抗原与一定量的酶标记抗体发生竞争性结合反应，反应平衡后经B/F分离，固相抗原与酶标抗体形成复合物被留下来，通过加入底物进行酶促发光反应，其发光量与待测标本中抗原含量呈反比。（二）游离和结合部分分离 是将游离酶标记物和酶标记物免疫复合物进行分离过程，常用分离技术有：1磁颗粒分离法2微粒

11、子捕获法3包被珠分离法 1磁颗粒分离法用抗原或抗体包被的磁颗粒与标本中相应抗原或抗体和酶标的抗体或抗原通过一定模式的免疫学反应后,最终通过磁场将结合酶标记物免疫复合物和游离酶标记物进行分离的技术。2微粒子捕获法与磁颗粒分离法所不同是所用颗粒是无磁性的微粒子作为抗体或抗原的包被载体, 然后用纤维膜柱子进行酶标记物的结合状态和游离状态的分离。3包被珠分离法将用聚苯乙稀等实验材料制成小珠, 在小珠上包被抗原或抗体,经抗原抗体反应后,将结合状态和游离状态的酶标记物进行分离。（三）酶促发光反应和结果计算以荧光酶免疫分析为例，加入底物4-MUP，酶标抗体上ALP将4-MUP分解，脱磷酸根基团后形成4-甲基

12、伞形酮（4-MU），它在360nm激发光的照射下，发出448nm的荧光，经荧光读数仪记录，放大，最后根据标准曲线由电脑计算出所测物质的含量。三、方法学评价1.灵敏度高 经过酶和发光两级放大，并加入发光增强剂以提高敏感度和发光稳定性，故方法学灵敏度较高。2.非特异性本底的问题 酶标抗体或酶标抗原因非特异性吸附而易造成较高本底，实验评价时应引起注意。3.非特异性酶的影响 血清中其他来源的过氧化物酶类物质由于洗涤不够彻底，易产生非特异性酶化学发光反应，影响测定结果。化学发光免疫分析 原 理 技术要点 方法学评价一、原 理化学发光免疫分析（chemiluminescence immunoassay，C

13、LIA）是用化学发光剂（吖啶酯）直接标记的抗原或抗体与待测标本中相应抗体或抗原、磁颗粒性的抗原或抗体反应，通过磁场把结合状态（B）和游离状态（F）的化学发光剂标记物分离开来，然后在结合状态（B）部分中加入发光促进剂进行发光反应，通过对结合状态（B）发光强度的检测进行定量或定性检测。图21-5 化学发光免疫分析反应原理（双抗体夹心法） 二、技术要点化学发光免疫分析的技术要点包括抗原抗体反应、标记物游离部分和结合部分分离、直接发光反应及检测等三部分。1抗原抗体反应抗原抗体反应类型同酶发光免疫测定技术，主要也有双抗体夹心法、双抗原夹心法和固相抗原竞争法等三种主要模式。现以双抗体夹心法为例，将包被单克

14、隆抗体的磁颗粒和待测标本加入到反应管中，标本中待测抗原与磁颗粒上抗体结合，再加上吖啶酯标记抗体，经过温育，形成磁颗粒抗体-抗原-吖啶酯标记抗体复合物。2游离和结合部分的分离常用磁颗粒分离技术，在电磁场中进行2-3次洗涤后，很快地将未结合的多余抗原和吖啶酯标记抗体洗去，而磁颗粒抗体-抗原-吖啶酯标记抗体复合物和磁颗粒抗体留下。3化学发光反应经过洗涤的磁性颗粒中，加入pH纠正液（NaOH）使其呈碱性，然后加入氧化剂（H2O2），这时吖啶酯在不需要催化剂的情况下分解并发光，由集光器进行接收，经光电倍增管放大作用，记录1秒钟内所产生的光子能，这部分光的积分与被测抗原含量成正比，根据标准曲线，仪器可以自

15、动计算出其抗原含量。三、方法学评价吖啶酯作为标记物的优点是其低背景噪音、化学反应简单、快速而无催化剂。吖啶酯用作标记物时，其与大分子的结合并无减少所产生的光量，从而增加灵敏度，灵敏度可达10-15g/ml。吖啶酯标记试剂有效期长，可达一年。固相分离剂为极为幼细的磁粉，除增大包被面积，加快反应外，亦同时使清洗及分离更简易、快捷。电化学发光免疫分析 原 理 技术要点 方法学评价一. 原 理电化学发光免疫分析(electrochemiluminescence immunoassay, ECLI)是电化学发光（ECL）和免疫测定相结合的产物。 它的标记物的发光原理与一般化学发光（CL）不同，是一种在电

16、极表面由电化学引发的特异性化学发光反应，实际上包括了电化学和化学发光两个过程。ECL与CL的差异在于ECL是电启动发光反应，而CL是通过化合物混合启动发光反应。用化学发光剂三联吡啶钌Ru(bpy)32+标记抗体，通过抗原抗体反应和磁颗粒分离技术，根据三联吡啶钌在电极上发出的光强度的大小对带测的抗原或抗体进行定量或定性。图21-6 电化学发光免疫分析技术反应原理(双抗体夹心法)二技术要点电化学发光免疫分析的技术要点也包括抗原抗体反应、标记物游离部分和结合部分分离、电化学发光反应及检测等三部分。1抗原抗体反应抗原抗体反应类型同酶发光免疫测定技术，主要也有双抗体夹心法、双抗原夹心法和固相抗原竞争法等

17、三种主要模式。现以双抗体夹心法为例，三联吡啶钌标记抗体和生物素标记抗体与待测标本同时加入一个反应杯中孵育反应，然后加入链霉亲和素包被磁珠，再次孵育，使生物素通过与亲和素的结合将磁珠、抗体连接为一体，形成双抗体夹心物即Ru(bpy)32+-抗体-抗原-抗体-生物素-链霉亲和素-磁珠复合体。2游离和结合部分的分离常用磁颗粒分离技术，蠕动泵将形成的双抗体夹心物吸入流动测量室，此时，磁珠被工作电极下面的磁铁吸附于电极表面。同时，游离的抗体（与生物素结合的和与Ru(bpy)32+结合的抗体）也被吸出测量室。3.电化学发光反应蠕动泵加入含三丙胺（TPA）的缓冲液，同时电极加电压，启动ECL反应过程。该过程

18、在电极表面周而复始地进行，产生许多光子，光电倍增管检测光强度，光强度与Ru(bpy)32+的浓度呈线性关系,根据标准曲线算出待测抗原的含量。最后，终止电压，移开磁珠，加入清洗液冲洗流动测量室，准备下一个样品测定。三方法学评价标记物的再循环利用，使发光强度更高、时间更长、易于测定具有灵敏度高，可达pg/ml水平线性范围宽反应时间短试剂稳定好等特点化学发光免疫技术是免疫测定技术继酶免技术（EIA）、放免技术（RIA）、荧光免疫技术（FIA）和时间分辨荧光免疫技术（TRFIA）之后发展的一项新兴测定技术。化学发光免疫技术是一种高度敏感的微量测定技术，凡具有抗原性的物质（包括半抗原）都可以用化学发光免

19、疫技术测定。其起步于80年代初，快速发展于90年代，在国外化学发光免疫技术的应用处于蓬勃发展的阶段。 化学发光免疫技术具备以下特点 ：高度敏感，极限达10-1710-19M/L，远高于RIA、EIA，与TRFIA相当但比TRFIA便宜。特异性强，重复性好C.V.5。测定范围宽，可达7个数量级。试剂稳定性好，无污染有效期612月。操作简单，易于自动化。 在对环保很重视的国家，CLIA成了取代RIA的首选方法。BECKMANCoulter ACCESS，ACCESS 2 化学发光免疫分析仪 ALP标记抗原或抗体 ，磁性微粒作为固相载体，抗体直接包被磁珠 AMPPD发光剂美国强生公司： Vitros

20、 Eci化学发光免疫分析仪 Luminol发光剂，3氯4羟基乙酰苯胺作增强剂 ， 塑料小孔管作为固相载体， 链霉亲和素包被磁珠， HPR标记抗原或抗体美国DPC公司 IMMULITE 2000化学发光免疫分析仪 ALP标记抗原或抗体， AMPPD发光底物， 塑料珠为固相 抗体直接包被塑料珠 ，离心分离固相及液相Bayer公司 ACS180，180plus，180SE 化学发光免疫分析系统 吖啶酯为发光标记物，用于标记抗体， 磁珠作为固相载体， 抗体直接包被磁珠ROCHE公司: 1010,2010,E170, 电化学发光免疫分析仪 采用：电化学发光技术，生物素-链霉亲和素技术， 磁性微粒为固相载体 三联吡啶钌作为发光剂,三丙胺作电子供体. 发光免疫技术在医学检验中应用化学发光免疫技术在灵敏度、特异度方面不仅可与RIA法相媲美,而且化学发光免疫技术的准确性和试剂盒的有效期等均优于RIA 法。由于化学发光免疫技术是以化学发光剂作为标记物进行定量检测,所以其试剂具有稳定和无毒的优点。本试验使用的全自动电化学发光仪