遗传性疾病的分子诊断教学课程课件

1、第十五章 遗传性疾病的分子诊断 基因工程研究所南方医科大学南方医科大学教学目的与要求 了解遗传性疾病分子诊断的方法学评价及产前（包括胚胎植入前）遗传缺陷分子诊断的适应症。熟悉遗传性疾病的分子机制及分子诊断的标准化。掌握遗传性疾病及产前（包括胚胎植入前）遗传缺陷的经典检测方法及临床意义。 重点遗传性疾病及产前（包括胚胎植入前）遗传缺陷的经典检测方法及临床意义。难点遗传性疾病的分子机制。南方医科大学本章目录第一节 遗传性疾病分子诊断的策略*第二节 遗传病的分子诊断第三节 产前（包括胚胎植入前）遗传缺陷的分子诊断*南方医科大学第一节 遗传性疾病分子诊断的策略*一、直接诊断策略二、基因多态性连锁分析三

2、、基因突变的定量（dosage）诊断 南方医科大学一、直接诊断策略定义：直接检测导致遗传性疾病的各种基因突变类型：点突变 缺失 插入 倍增前提：基因已经克隆，序列和结构清楚南方医科大学(一)点突变的诊断1、 基因背景清楚的点突变等位基因特异性寡核苷酸杂交(allele specific oligonucleotide, ASO)PCR-ELISA等位基因特异性扩增(allele specific amplification, ASAPCR-RFLP测序基因芯片技术等进行诊断南方医科大学2、基因背景未知的点突变单链构象多态性(single-strand conformational polymo

3、rphism, SSCP)变性梯度凝胶电泳(denaturing gradient gel electrophoresis, DGGE)异源双链分析(heteroduplex analysis, HA)DNA序列测定蛋白截短测试（protein truncation test, PTT） 南方医科大学(二)片段性突变的检测 （1）少数核苷酸缺失或插入 检测点突变的方法（2）大的片段突变 Southern印迹技术、多重PCR技术。片段性突变是指DNA分子较大范围发生突变， 碱基的缺失、插入、扩增和重组。南方医科大学二、基因多态性连锁分析检测原理：多态性连锁分析、关联分析检测前提：致病基因尚未被定

4、位和阐明基因太大突变种类太多检测方法：RFLP，VNTR，STR，SNP南方医科大学三、基因突变的定量诊断检测方法：细胞分裂中期染色体检测 固相杂交 PCR 扩增检测内容：大范围的重复、缺失南方医科大学方法分辨率(碱基数)说明细胞分裂中期染色体检测染色体常规细胞培养至细胞分裂期染色；CGH5 x 106细胞分裂中期染色体作为探针来检测和控制不同的杂交；FISH5 x 104用修饰（如纤维探针）来增强分辨率；阵列CGH5 x 104使用阵列化的细菌人工染色体载体（Bacterial artificial chromosomes，BACs）而非细胞分裂中期染色体作为探针；MAPH不确定将探针与基因

5、组DNA杂交，然后再扩增探针；微卫星PCR1 x 102取决于缺失区已知的微卫星；差异PCR1 x 102要求精心控制起始DNA的质和量，结果为相对量，是一种半定量方法；竞争PCR1 x 102准确，结果为摩尔数，是一种绝对定量方法；Real-time PCR1 x 102成本较高，可有多种方法如Taqman法或分子信标法的SYBR Green染料或探针，应用越来越广泛；长片段 PCR1 x 102检测基因内缺失比重复更有效，可以确定突变的性质。南方医科大学第二节 遗传病的分子诊断一、血红蛋白病二、血友病三、肌营养不良症四、苯丙酮尿症五、囊性纤维化六、亨廷顿病七、脆性X综合征南方医科大学一、血

6、红蛋白病血红蛋白具有4个亚基组成的四级结构，每个亚基可结合1个血红素并携带1分子氧。Hb亚基之间通过8对盐键，使4个亚基紧密结合而形成亲水的球状蛋白。 南方医科大学珠蛋白基因簇16p13.33-p13.11南方医科大学1115.5珠蛋白基因簇:南方医科大学血红蛋白的类型成人Hb ：Hb A 22 9798% Hb A2 22 23 % 胎儿Hb： Hb F 22 2G2 2A2胚胎Hb： Hb Gower 22 2G2 2A2 (妊娠12周内) Hb Gower 22 Hb Portland 22 南方医科大学血 红 蛋 白 类 型南方医科大学血红蛋白病hemoglobinopathy 结构异

7、常血红蛋白病 镰刀状细胞贫血； 不稳定血红蛋白病 血红蛋白M病 氧亲和力改变地中海贫血， 珠蛋白的合成降低或消失南方医科大学1、镰刀形红细胞贫血正常细胞镰刀形细胞镰刀状贫血病血液中大量出现镰刀红细胞，其携带氧的功能只有正常红细胞的一半，患者常因此缺氧窒息。南方医科大学N-val his leu thr pro glu glu C(146)HbS 肽链HbA 肽 链N-val his leu thr pro val glu C(146)镰刀状细胞贫血分子机制 GTG CAT CTG ACT CCT GAG GAGGTG CAT CTG ACT CCT GTG GAG南方医科大学分子诊断方法限制性

8、内切酶法（RE）ASOARMS、跨越断裂点的PCR (裂口PCR、gap-PCR)南方医科大学S 肽链A肽链 ACT CCT GAG GAGACT CCT GTG GAGRE法 (Southern Blot)MstII CC TNA GG GG ANT CC1.15 kb0.2 kb1.35 kbASSA南方医科大学S 肽链A肽链 ACT CCT GAG GAGACT CCT GTG GAGRE法 (PCR-RFLP)DdeI C TNA G G ANT C268 bpASSA175 bp175268 443南方医科大学思考题（作业）书中239页中关于HbE检测请回答下列问题（1）HbE的突变

9、碱基改变情况 (2) 该突变位于蛋白质的第几个氨基酸（3）突变位点位于氨基酸哪一个外显子上（4）写出基因组参考序列中此外显子后的内含子序列（5和3端各5个碱基） (5) 用MnlI酶切后，请列出各种可能的情况（6）结合所学习的知识，请再写出几种可能用于诊断的方法。南方医科大学 2.地中海贫血 由于珠蛋白链的合成不平衡所造成的一类常见的单基因遗传性、溶血性疾病。类型：地中海贫血， 地中海贫血， 地中海贫血， 地中海贫血，以此类推。南方医科大学地 中 海 贫 血南方医科大学地中海贫血 每条16号染色体上有两个Gene缺失程度不同，链合成部分或完全受到抑制，导致不同类型的地贫。 若一条染色体上缺失一

10、个基因（）为+地贫，链合成减少。若一条染色体上两个基因均缺失（ ）为0地贫，链不能合成。南方医科大学临床类型类 型症 状正常人静止型+地贫杂合子无症状轻 型（标准型）0地贫杂合子轻度贫血+地贫纯合子血红蛋白H病0地贫和+地贫双重杂合子溶血性贫血Hb Barts胎儿水肿综合征0地贫纯合子胎儿水肿南方医科大学胎 儿 水 肿 南方医科大学地贫的分子基础 依基因缺陷程度分为：Gene缺失型（缺失1个基因）非Gene缺失型（点突变）：无义突变、移码突变、终止密码突变、剪接突变等结果 1 生成无功能或稳定性降低的mRNA 无义突变 移码突变 终止密码突变 起始密码突变 2 RNA加工突变 3 产生不稳定H

11、b南方医科大学地中海贫血的分子机制 南方医科大学分子诊断方法 (1) PCR法 PCR 法已经成为鉴别缺失型 地中海贫血的首选方法。(2) ARMS法 该法能快速鉴别诊断HbC S和HbQ S(3) ASA法 与ARMS 法相类似(4) SSCP法 非缺失型2 地中海贫血突变 (5) 等位基因特异性扩增技术(ASPCR）法南方医科大学地中海贫血 珠蛋白Gene 突变或缺失珠蛋白链合成速率下 降溶血性贫血 0 地贫：链完全不能合成 + 地贫：链可部分合成南方医科大学-地中海贫血临床分类临 床 类 型基 因 型基 因 产 物临 床 表 现重型地贫+/+、0/0 0/0、+/0 链几乎不能合成链合成

12、相对增加Hb F和Hb A2增高地中海贫血面容溶血性贫血（需输血）轻型地贫+/A、0/A0/A能合成适量的链贫血不明显或轻度贫血中间型地贫+/+ 链部分合成介于重型和轻型之间（不需输血）遗传性胎儿血红蛋白持续增多症缺失或突变链和链合成受抑制链合成明显增加成人Hb F持续增加，无症状南方医科大学患儿颅骨及面颊部骨骼增大，头颅变大，额部隆起，颧高，鼻梁塌陷，两眼距离增宽，眼睑浮肿，形成地中海贫血的特殊面容。南方医科大学X线颅骨照片可见颅骨内外板变薄，板障增宽，在骨皮质间出现垂直短发样骨刺南方医科大学-地中海贫血的分子基础 地中海贫血已发现100多种突变类型，包括点突变和 基因缺失。 绝大多数地中海

13、贫血是由于基因发生点突变所致，突 变涉及基因内及侧翼序列。（1）编码区突变（2）非编码区突变（3）启动子区突变（4）RNA裂解信号突变（5）加帽位点单个碱基突变南方医科大学编码区突变 mRNA稳定性降低或形成无功能mRNA（1）无义突变 密码子17：AC 密码子43：GT 0 地贫（2）移码突变 密码子71/72：+A 密码子41/42：TCTT 0 地贫（3）起始密码突变 ATGAGG 0 地贫南方医科大学 内含子I GTAT丧失一个剪切信号。 新的切点产生 同义突变激活I和 Exon隐蔽裂解位点 如：GGTAGT 产生新的剪切点非编码区突变 影响mRNA剪切、加工过程南方医科大学GTATG

14、GTAGT，激活隐蔽剪切位点南方医科大学启动子区突变 降低mRNA的转录效率-28位AG 突变破坏了TATA Box。南方医科大学RNA裂解信号突变 不能准确裂解和加polyA珠蛋白基因 3侧翼序列中AATAAAAACAAA加帽位点单个碱基突变 不能准确裂解和加polyA加帽位点发生AC颠换，影响转录效率。通常是mRNA的第一个核苷酸。南方医科大学分子诊断方法 PCR反向点杂交(PCR-RDB)法PCRRFLP法基因芯片法等 ND1234658710911南方医科大学 二、血友病 人体的凝血过程需要多种凝血因子参加。由于凝血因子基因的缺陷而使其中某一凝血因子蛋白表达降低或缺如即造成血友病(he

15、mophilia)。85 的血友病患者是由于血浆中缺乏凝血第8 因子(F)所致，约10的患者是由于缺乏凝血第9 因子(F)，前者称为甲型血友病，后者称为乙型血友病 。南方医科大学 （一）甲型血友病及其分子诊断甲型血友病是由于凝血因子(F)即抗血友病球蛋白(antihemophilic globulin, AHG)缺乏所导致的凝血机制异常的遗传性疾病。 南方医科大学 2甲型血友病的分子机制 在F 基因区域内，有一种A基因存在三个拷贝，其功能不详，其中一个A基因位于F基因的第22 号内含子内(A1)，另外两个位于X染色体的末端(A2、A3)。A1 基因可以与其上游的两个A基因拷贝中的一个发生同源重

16、组，引起F基因的1-22 外显子片段倒位，这种倒位导致F 功能完全丧失而发生严重的血友病 。南方医科大学甲型血友病分子诊断 （1）基因倒位的检测 由于50左右的甲型血友病是由于F 基因中的22 号内含子倒位引起的，所以检测该突变成为对患者进行基因诊断的首选方法。在检测基因倒位的方法中首选的是长距离PCR(LD-PCR)技术。 南方医科大学(2)非基因倒位的检测 点突变是非基因倒位引起甲型血友病的主要原因，因此对该类患者的家系分析和携带者的基因检测主要是通过点突变的检测技术进行。 南方医科大学1)PCR-RFLP法 2)VNTR法 3)STR法 4)PCR-SSCP法 南方医科大学 （二）乙型血

17、友病及其分子诊断乙型血友病，又称Christmas 病或血浆凝血活酶成分(plasma thromboplastin component, PTC) 缺乏症，是凝血因子(F)缺陷所致的一种严重的遗传性出血性疾病。 南方医科大学分子机制为编码F基因缺陷，导致F含量缺乏或结构异常，从而凝血功能障碍。临床表现与甲型血友病完全相似。 南方医科大学分子诊断 直接测序法、 基因芯片法和毛细管电泳(capillary electrophoresis, CE)；间接检测方法有：RFLP法、SSCP法、DGGE法、双脱氧指纹图谱(dideoxy fingerprint, ddF)、变性高效液相色谱法(denat

18、uring high performance liquid chromatography, DHPLC） 南方医科大学三、肌营养不良症 肌营养不良症又称为假性肥大性肌营养不良。主要有杜氏肌营养不良症(Duchenne muscular dystrophy, DMD)和贝氏肌营养不良症(Becker muscular dystrophy, BMD)，它们是一种常见的X连锁性隐性遗传病，因此患者都为男孩。 南方医科大学发病机制 主要为抗肌萎缩蛋白基因（dystrophin gene)的突变导致肌细胞膜上的抗肌萎缩蛋白(dystrophin)发生结构和功能的改变所致。 Dystrophin 是抗肌萎

19、缩蛋白基因(DMD基因)的产物，当DMD 基因突变后Dystrophin 合成缺乏，该复合物无法有效形成，使细胞膜不稳定，最终造成肌细胞因通透性增加而变性或坏死，导致DMD 的发生。 南方医科大学 2杜氏和贝氏肌营养不良症的分子诊断 (1)多重PCR技术 （2）短串联重复序列(short tandem repeat, STR)连锁分析（3）定量PCR技术 （4）RT-PCR技术 南方医科大学四、苯丙酮尿症PKU是由挪威科学家Folling 发现的，当时被命名为“苯丙酮尿性智力发育不全” ，1937 年Penrose 和Quastel 将之命名为苯丙酮尿症(phenylketonuria, PK

20、U)。其主要是由于肝内苯丙氨酸羟化酶（phenylalanine hydroxylase, PAH）严重缺失所致的苯丙氨酸代谢异常，为常染色体隐性遗传病。 南方医科大学(二)苯丙酮酸尿症的分子诊断1PCRSTR 连锁分析 2PCR-SSCP法3PCR-RFLP 4多重ASPCR法 南方医科大学 五、囊性纤维化(cystic fibrosis, CF)CF是由囊性纤维化穿膜传导调节因子(cystic fibrosis transmembrane conductance regulator, CFTR)基因突变所致，为白种人中最常见一种家族常染色体隐性遗传性先天性致死性疾病，多累及儿童和青年，发病

21、率以西、北欧及北美人群为高。CF常累及胃肠道和呼吸道，极易发生呼吸道感染而引起气道梗阻及呼吸功能不全，多数病人仅能成活数年到十余年。 南方医科大学CF分子机制 CFTR基因突变已达1000 余种，已知的CF突变在CFTR基因中的分布是非随机的，绝大多数集中于编码CFTR蛋白NBFs区的外显子9、10、11、12、19、20、21、22 ，跨膜区的外显子3、4、7、14a、14b、17b以及R区的第13 外显子，其中除F508 及另外十余种较为常见的突变外，其余均为罕见突变或仅见于个别病例。 南方医科大学CF 分子诊断 早期CF的基因诊断基于RFLP连锁分析，采用的探针多为基因克隆过程中获得的基

22、因侧翼DNA片段。在CF基因克隆和测序以后，PCR技术被用于直接基因诊断。同时，新的突变分析方法也相继问世。 南方医科大学 六、亨廷顿病 亨廷顿病（Huntingtons disease, HD)是一种有IT 15 基因上CAG 重复序列一场扩展所致常染色体显性遗传的以舞蹈运动为主要特征神经退行性的疾病。 南方医科大学HD 分子机制 HD即由CAG重复序列的异常扩展突变引起，CAG 重复范围在正常的染色体为935个拷贝，而在HD 患者的染色体上，重复长度大于拷贝，CAG 的拷贝数目与HD的发病年龄负相关，其基因突变率在人类单基因遗传性疾病中最低。 南方医科大学HD的分子诊断 针对不同个体运用三条引物进行PCR 扩增，扩增产物变性聚丙烯酰胺凝胶电泳放射自显影鉴定IT 15 基因（CAG)串联重复序列拷贝数，此法能对超过95HD 患者诊断和排除诊断。 南方医科大学 七 脆性X综合征 脆性X综合征（fragile X syndrome, FraX）是仅次于Downs 综合征的