分子生物学三-蛋白质组学

1、1蛋白质组学ProteomicsShen Y温州医科大学 检验医学院 生命科学学院2蛋白质是基因的表达产物和基因功能的执行者，基因组所包含的功能信息必须在蛋白质水平上进行解释，才能最终得到明确的结论。因此，要想阐明生命过程的本质，对蛋白质组的研究就成了一个必然的选择。 3Genome = static compositionProteome = highly flexible compositionIdentical Genome but different looks?4Identical TwinsImportant traitsThrough the proteome5蛋白质组研究的必要

2、性蛋白质基因多少动态静态翻译后修饰序列恒定组分复杂简单网络独立6 100,000 proteins3 billion bases28,000 genes 人类基因组中绝大部分基因及其功能有待于在蛋白质水平上加以揭示与阐述。 7 基因组 转录组 蛋白质组8基因组告诉你，理论上能够发生什么？mRNA告诉你，可能发生什么？蛋白质组告诉你，正在发生什么？9蛋白质组（proteome）：PROTEins + genOME，意思是Proteins expressed by a genome（基因组表达的所有蛋白质）1994年由澳大利亚科学家Wilkins提出，是一个动态的概念，指的是不同细胞在不同时相表达

3、不同的蛋白质 蛋白质组（原核生物和真核生物）对应于基因组的所有蛋白质构成的整体，不是局限于一个 或几个蛋白质同一基因组在不同细胞、不同组织中的表达情况各不相同 在空间和时间上动态变化着的整体整体性、动态性和系统性3.1概述10蛋白质组学(proteomics): 指应用各种技术手段来研究蛋白质组的一门新兴科学，其目的是从整体的角度分析细胞内动态变化的蛋白质组成成份、表达水平与修饰状态，了解蛋白质之间的相互作用与联系，揭示蛋白质功能与细胞生命活动规律。细胞器蛋白质组学：通过纯化细胞器或用质谱仪鉴定蛋白质复合物组成来确定蛋白质在亚细胞结构中的位置。表达蛋白组学：把细胞、组织中的所有蛋白质建立成定量

4、表达图谱或扫描EST图。蛋白质组学包括:3.1.3 蛋白质组学11Western blot、免疫组化验证蛋白质并确定其定位根据氨基酸序列合成寡核苷酸探针，克隆基因蛋白质功能研究，包括蛋白质生物活性、抗体制备、蛋白质相互作用等方面蛋白质样品电泳前蛋白质样品的处理双向电泳分离 Western blot检测选择目标蛋白斑点，胶内酶切质谱分析（MALDI/TOF或ESI/MS/MS）获得肽质量指纹谱或肽序列标签数据库检索鉴定蛋白质电转印到膜上 图像分析 样品处理蛋白质分离蛋白质鉴定 蛋白质组学研究流程图12蛋白质组学的研究内容1、蛋白质组表达模式（组成）的研究蛋白质组成分鉴定、数据库构建、新型蛋白质的

5、发现、同源蛋白质比较、蛋白质加工和修饰分析。2、蛋白质组功能模式（作用）的研究基因产物识别、基因功能鉴定、基因调控机制分析。重要生命活动的分子机制（如细胞周期、分化与发育、环境反应与调节等）。医药靶分子的寻找和分析（包括新药靶分子、肿瘤分子标记、人体病理介导分子等）。133.2.3 蛋白质组研究技术一、双向凝胶电泳技术二、液相色谱技术三、生物质谱技术与蛋白质鉴定四、蛋白质相互作用的研究技术14 一、双向凝胶电泳技术（一）2-DE的概念two dimensional gel electrophoresis 2-DE是指第一向的固相pH梯度（immobilized pH gradient，IPG）

6、等电聚焦电泳与第二向SDS组成的分离系统，也称双向聚丙烯酰胺凝胶电泳，简称2-DE。等电聚焦电泳是基于蛋白质等电点（pI）的差异进行分离，SDS则是根据蛋白质分子量（Mw）的不同进行分离。 15第一向等电聚焦酸碱IPG胶条pH梯度低分子量高分子量第二向SDS图7-2 双向凝胶电泳示意图161、第一向电泳IPG等电聚焦电泳 1）等电聚焦电泳的基本原理 等电聚焦（IEF）是60年代发展起来的一种蛋白质分析分离手段，如图所示，在电场中电泳基质形成一个从正极到负极不断增大的pH梯度，由于蛋白质为两性电解质，带负电荷的蛋白质分子向正极移动，带正电荷的蛋白质分子向负极移动，当蛋白质分子运动到各自的pI处时

7、，所带净电荷变为零，于是停止迁移而留在该位置上。这种不同的蛋白质分别聚集在各自的pI处，形成一条狭窄稳定的区带而彼此分开的现象称为等电点聚焦。171098765432pHpI8.0蛋白质pI4.0蛋白质 等电聚焦的“聚焦效应”18+pH 3pH 7.5pH 10+pH 3pH 7.5pH 10+pH 3pH 7.5pH 10+pH 3pH 7.5pH 10第一向：等电聚焦19第一向 等电聚焦IEF20212、第二向电泳SDS- PAGE1）SDS的原理 在PAGE系统中加入SDS和还原剂后所组成的电泳系统。SDS是一种阴离子去垢剂，疏水端能插入蛋白质分子内，破坏蛋白质分子内的氢键及疏水作用，改

8、变蛋白质分子的三级和四级结构；还原剂则断裂蛋白质分子内的二硫键，使蛋白质分子去折叠，结构变得舒展。蛋白质分子与SDS充分结合后，形成带负电荷的蛋白质-SDS复合物，所带负电荷大大超过蛋白质分子原有的电荷量，消除了不同分子间原有电荷的差异。蛋白质-SDS复合物在聚丙烯酰胺凝胶电泳系统中的迁移率不再与电荷相关，而主要取决于椭圆棒的长轴长度，即蛋白质的分子量大小。 22第二向 SDS23+pH 3pH 7.5pH10chargesize第二向：SDS电泳Proteins migrate through the gel at a rate proportional to their size.Smal

9、lest proteins travel the furthest distance24双向电泳的流程样品制备第一向等电聚焦第二向SDS凝胶上蛋白的检测蛋白的软件的检测25（二）凝胶上蛋白质的检测蛋白质样品经2-DE分离后，凝胶上的蛋白质斑点须用一定的方法使其显现出来，让仪器或人眼检测到。2627染色方法考马斯亮蓝染色银染（不含戊二醛）荧光染色（Cy3, Cy5），放射性同位素标记等28 （一）考马斯亮蓝染色 考马斯亮蓝染色是最常用的蛋白质染色方法。考马斯亮蓝R-250化学名为三苯基甲烷，R代表红蓝色。考马斯亮蓝R-250与蛋白质的碱性基团可逆结合，染色线性范围可达155g，灵敏度为30100

10、ng蛋白质。考马斯亮蓝染色的最大优点是染色重复性好，操作简便，不影响后续的质谱鉴定，灵敏度比常用的氨基黑高100倍，但低于银染色和荧光染色，不能满足对低丰度蛋白质的检测要求，样品用量大。29 （二）银染色 原理 在酸性硝酸银溶液中蛋白质与银离子发生作用，然后在碱性pH条件下，银离子被甲醛还原成银颗粒沉淀在蛋白质上而呈显棕黑色。银染色灵敏度很高，是考马斯亮蓝染色法的100倍，但操作繁琐，重复性不如考马斯亮蓝染色，对糖蛋白、钙结合蛋白的染色效果差。30考染和银染的比较31 (三) 荧光染料染色 荧光染料染色法是利用结合于蛋白质的荧光染料发出的荧光来检测蛋白质。用于蛋白质染色的荧光染料很多，有的共价

11、结合于蛋白质上，有的和蛋白质形成非共价结合。目前商品化的荧光染料有SYPRO Ruby, 其染色方法操作简便，灵敏度高达110ng，染色线性范围宽，对糖蛋白、脂蛋白染色效果好，不影响后续的质谱鉴定，是一种较理想的蛋白质染色方法，但价格较昂贵。 32（三）双向凝胶电泳图谱的计算机分析细胞或组织样本经2-DE分离后，得到一张含有成百上千个蛋白质斑点的凝胶电泳图谱。凝胶图谱分析包括确定蛋白质斑点的位置、大小、染色深浅、pI和分子量；图谱间的比较、差异蛋白质斑点的确定；图谱质量的优化、数据的储存管理、数据库分析等内容。借助先进的计算机技术和生物信息学工具，能客观、有效地从电泳图谱中提取到有价值的信息。

12、 33（四） 2-DE的分辨率、重复性及局限性2-DE系统有很高的分辨率。商品化的IPG胶条以及标准化的实验操作使得2-DE具有很高的重复性，可在不同实验室间进行图谱的比较，给蛋白质组数据的共享带来了极大的方便。目前没有一种分离技术在分辨率上能与双向凝胶电泳相媲美。 342-DE存在的不足和缺陷：首先，2-DE的分辨率仍不能满足蛋白质组学研究的需要，人类基因组有2万3万个基因，可能表达的蛋白质达数十万种，这对2-DE技术的分离能力提出了严峻挑战；其次，2-DE对极酸、极碱性和疏水性膜蛋白的分离效果不尽人意，对具有重要功能的低丰度蛋白质的检测也是个很大的难题；最后，2-DE操作过程的自动化是一个

13、亟待解决的难点，自动化的操作平台可减少人为误差，提高实验结果的重复性，带来高通量的分析速度，满足大规模蛋白质组学研究的需要。35（五）双向凝胶电泳分离前的样品处理 1、分部提取法 用不同的蛋白质提取液分部抽提细胞或组织裂解液，先用水溶液抽提，离心后的上清液中含大部分水溶性蛋白；再用对膜蛋白具有中等溶解度的提取液抽提沉淀，离心后上清液中含中等疏水性的蛋白质，包括膜表面蛋白和膜相关蛋白；最后用强溶解力的提取液抽提沉淀，得到疏水性强的蛋白质。 36 2、亚细胞成分的分离 亚细胞成分的分离是指分离细胞中的各种细胞器和亚细胞结构，如细胞核、线粒体、细胞骨架、核基质、核仁等，用于蛋白质组研究。这是近来蛋白

14、质组学研究中兴起的一个分支亚细胞蛋白质组学，它不但可提高蛋白质的检出效率，还能获得许多关于亚细胞结构和功能方面的重要信息。 373、激光捕获显微切割技术（LCM） 1996年基因公司发明了一种称为激光捕获显微切割（LCM）的新技术，即在显微镜下从组织切片中分离、纯化单一类型细胞群或单个细胞的技术。它成功地解决了组织中的细胞异质性问题,是分子病理学和肿瘤基因组学研究的一项革命性技术 38二、生物质谱技术与蛋白质鉴定（一）质谱的基本原理质谱分析法（MS）是指在一定条件下，将样品分子电离成离子，然后通过测定这些离子的质荷比（m/z）和强度来进行定性和定量的一种分析方法。质谱分析法的过程为：将样品气化

15、并电离成带电离子，然后通过一定方法将不同m/z的离子分开，并测定其强度，绘出质谱图，对质谱图进行分析可得到关于样品分子结构和定量方面的信息。39UB m v2 F= Bzv F Rm 离子源 S质谱方程 ：离子检测器图7-5 质谱仪的原理40有机分子受到电子轰击后，会断裂形成不同的多种离子，以离子的质荷比m/z为横座标，离子强度为纵坐标作图，得到的质谱图称为标准质谱图，也叫棒图。 4110 0806040200204010 08060分子离子峰基峰相对强度（）质荷比（m/z)图7-6 质谱棒图42 完整的现代质谱仪由进样系统、离子源、质量分析器、离子检测器、数据处理及控制系统五部分组成，此外还

16、有一个保持质谱仪高真空度的真空系统。离子源和质量分析器是质谱仪最重要的两个部件，也是不同质谱仪的主要差别所在。电喷雾质谱（ESI）和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI）为离子源的质谱技术已广泛应用于生物大分子研究，是蛋白质组学研究中不可或缺的分析工具，因此被称为生物质谱（BMS）。 进样系统离子源质量分析器检测器数据采集及分析真空系统 （二）生物质谱 43（三）蛋白质的鉴定蛋白质样本经2-DE分离后，需对蛋白斑点进行鉴定，以确定其身份。利用获得的蛋白质斑点的各种属性参数，在蛋白质数据库中进行检索，寻找与这些参数相符合的蛋白质。如果在数据库中搜寻不到，可能为新蛋白质，需用其它方法进一步

17、鉴定和研究。 44蛋白质组学研究需要有高通量的蛋白质鉴定方法，MS技术能快速、准确地获得多种蛋白质属性参数，结合生物信息学工具，可迅速进行蛋白质的鉴定。因此，MS已成为蛋白质组学研究中不可或缺的有力工具。下面介绍两种应用MS技术进行蛋白质鉴定的方法。 451、肽质量指纹图谱法 基本过程为：蛋白质混合物样品经过2-DE分离后，从胶上切下需要鉴定的蛋白质斑点，用胰蛋白酶进行水解，胰蛋白酶在特定位点切割蛋白质，形成长短不一的多肽混合物，用MALDI-TOF质谱仪对多肽混合物进行质量分析，得到肽片段质谱图，一个质谱峰代表一种肽片段离子。由于各种蛋白质的一级结构不同，胰酶水解后产生的肽片段数目及质量均不

18、相同，具有特征性，因此将得到的肽片段质谱图称为PMF。下图为卵白蛋白PMF：46472、肽序列标签鉴定法 蛋白质由20种氨基酸组成，在蛋白质上随意选取一个四肽序列，根据概率论计算，另一个蛋白质上出现相同四肽序列的概率为1/204，即1/160,000，因此从理论上说，只要测定一个蛋白质中56个氨基酸残基的序列，就足以作为鉴别蛋白质的特异性标签，称为肽序列标签。48四、蛋白质相互作用的研究技术蛋白质功能的研究是一项艰难而又重要的工作，它是阐明生命现象本质的必由之路。任何蛋白质，不管它是酶、抗原、抗体，还是信号转导分子，必须和其它蛋白质分子（或非蛋白质分子）在空间上相互接近，形成某种相互作用，才能

19、发挥功能作用。因此，研究蛋白质的相互作用对阐明其功能具有重要意义 。49酵母双杂交技术 1、基本概念 酵母双杂交技术(yeast two-hybrid system)是20世纪90年代初期发展出来的一种用于研究蛋白质相互作用的方法手段，它利用酵母细胞内的真核表达系统，将两种外源蛋白质的基因分别与酵母转录因子的两个功能结构域融合，通过质粒导入酵母细胞，以酵母细胞表型的改变作为外源蛋白是否发生相互作用的筛选标志。502、基本原理酵母双杂交系统利用真核生物转录调控因子的组件式结构特征。这些蛋白质往往由两个或两个以上相互独立的结构域构成。DNA结合结构域（DNA binding domain，BD）和

20、转录激活结构域（activation domain，AD）是转录激活因子发挥功能所必须的。单独的BD能与特定基因的启动区结合，但不能激活基因的转录。而由不同转录调控因子的BD和AD所形成的杂合蛋白却能行使激活转录的功能。51UASLacZ/His报告基因表达X外源基因 BDGAL4 DNA-BD外源基因GAL4 ADADDNA-BD 质粒AD质粒表达表达融合蛋白融合蛋白图710 酵母双杂交原理图Y BDXYADYADRNA多聚酶 BDX523.3 蛋白质组学的研究意义及应用3.3.1 蛋白质组学的研究意义3.3.2 蛋白质组学的应用53研 究 意 义DNA RNA 蛋白质存在3个层次的调控转录水平调控翻译水平调控翻译后水平调控蛋白质存在复杂的翻译后修饰，作为生命功能的行使者，它比基因更能直接地反映生理过程及其变化。蛋白质相互作用及空间构向等问题是生命现象复杂性的真实体现。54疾病的蛋白质组研究 病原微