生物化学过氧化氢酶Km值测定

1、过氧化氢酶米氏常数的测定生物化学实验1一、实验目的了解米氏常数的意义，测定过氧化氢酶的米氏常数。学习一种测定酶Km值的方法熟悉和掌握过氧化氢酶活性的测定原理和方法2二、相关知识与原理米氏方程与米氏常数（Km值） 米氏方程Km值: 酶促反应速度为Vmax/2时的 底物浓度。单位是mol/LVmaxS Km + S 相关知识3Km值的含义Km值是酶的特征性常数之一Km值可近似表示酶对底物的亲和力同一酶对于不同底物有不同的Km值测定Km是研究酶的一种重要方法，大多数酶的Km值在0.01100mmol/L之间。 4双倒数作图法 VmaxS Km+SV = 两边同取倒数 （林贝氏方程） + 1/V=Km

2、Vmax 1/Vmax 1/S 绘制1/S 与1/V的标准曲线，其与X轴的交点即为1/Km ，以此求得该酶在测定条件下的Km值。Km值的测定方法5实验原理过氧化氢酶催化2H2O2 2H2O+O2 反应一定时间后，剩余过氧化氢进行下述反应2KMnO4+5H2O2+3H2SO4 2MnSO4+K2SO4+5O2+8H2O用KMnO4滴定可求出反应前后H2O2的浓度差即反应的速度。6用不同的H2O2的起始量代表同一体系不同时刻的底物浓度。根据不同的底物浓度和对应的反应速度绘制标准曲线。从坐标图上读出-1/Km，计算Km值。71、0.02mol/L 磷酸盐缓冲液（ pH7.0 ）。2、0.02mol/

3、LKMnO4：称取 KMnO4 3.2 g，加蒸馏水 1000 mL，煮沸15 min，2d后过滤，棕色瓶保存3、0.004mol/L KMnO4：称取恒重草酸钠0.2 g，加 250mL冷沸水及10mL浓硫酸，用0.02mol/L KMnO4 滴定至至微红色，加热至65 ，继续滴定微红色30s不褪，算出KMnO4的准确浓度稀释成0.004mol/L即可。三、试剂84、0.05mol/L H2O2:30% H2O2 23ml 加入1000ml 容量瓶中，加蒸馏水至刻度，用 0.004mol/L KMnO4 标定其准确浓度 (标定前稀释4倍，取2mL，加25% H2SO4 2mL，用0.004m

4、ol/L KMnO4 滴定至微红色)。(标定0.05 mol/L H2O2的实际浓度为0.053mol/L)5、25% H2SO4 5Na2C2O4+2KMnO4+8H2SO4=10CO2+2MnSO4+K2SO4+8H2O+5Na2SO491、酶液的制备： 每组(共分6组)称取马铃薯5g，加磷酸缓冲液 10mL，研钵匀浆，滤纸过滤。四、实验步骤102、反应速度的测定：取干燥的50-100ml锥形瓶6只，编号后按下表操作：试剂（mL）012345H2O2溶液/mL01.001.251.672.505.00蒸馏水/mL9.58.508.257.837.004.50酶液/mL0.500.500.500.500.500.50 先加好0.053mol/L H2O2和蒸馏水，加入酶液后立即混合摇匀并计录时间，各瓶准确静置5分钟后，立即加入25% H2SO4 2.0mL，边加边摇，以终止酶促反应。最后用标准0.004 mol/L KMnO4滴定剩余的H2O2至微红色，记录各瓶耗KMnO4的mL数。 113、实验数据收集（根据实验进程填写下表）12注意事项反应瓶中H2O2浓度计算： SH2O2摩尔浓度加入H2O2的mL数 10 加入H2O2的摩尔数 10 （mmol/mL）13反应速度的计算 V = 加入的H2O2的毫摩尔数剩余的H2O2的毫摩尔数/5min = H2O2的摩