体内药物分析方法建立与验证课件

1、第四章 体内药物分析 方法的建立与验证8/6/20221体内药物分析分析方法的设计依据分析方法建立的一般步骤分析方法验证的内容与要求体内药物分析应用示例本章内容提要8/6/20222体内药物分析【大纲要求】1、掌握体内药物分析方法的评价2、熟悉体内药物分析方法建立的思路、分析方法建立的一般实验步骤8/6/20223体内药物分析第一节 分析方法的设计依据建立分析检测方法的主要依据待测药物的理化性质及在生物体内的存在状况分析测定的目的与要求生物样品的类型与预处理方法实验室条件第四章 分析方法的建立与验证8/6/20224体内药物分析一、待测药物的理化性质及体内存在状况 准确测定生物样品中的药物或其

2、特定代谢物通过一定的生物样品预处理使待测物从结合物或缀合物中释放出来。故此，应首先考虑样品预处理方法待测药物的理化性质药物在生物体内的存在状况药物在生物体内的生物转化(代谢)途径第四章 分析方法的建立与验证第一节 分析方法的设计依据8/6/20225体内药物分析(一)待测药物的理化性质药物的pKa值、亲脂性、溶解度、分配系数等预处理及检测方法具有亲脂性在适当的pH值下用溶剂萃取具有强极性或亲水性沉淀蛋白、固相萃取、离子对萃取或衍生化后萃取等具有挥发性GC测定法具有光谱或电化学特性分析检测方法药物的稳定性萃取浓缩技术对酸碱不稳定避免使用强酸或强碱性溶剂 对热不稳定避免高温蒸发溶剂第四章 分析方法

3、的建立与验证第一节 分析方法的设计依据8/6/20226体内药物分析(二)待测药物的体内存在状态与血浆蛋白结合的强弱及结合率的高低分离萃取方法蛋白结合较强不宜直接采用溶剂萃取体内浓度高低、代谢过程及其代谢产物分析检测技术浓度较低（尤其有代谢产物共存）代谢产物的干扰与特定代谢产物的同时测定采用LC-MS等分析检测技术 第四章 分析方法的建立与验证第一节 分析方法的设计依据8/6/20227体内药物分析二、分析测定的目的与要求体内药物分析的目的影响分析方法的应用药代动力学研究药物在体内吸收、分布、代谢和排泄过程血浆浓度随时间的变化过程；代谢途径及代谢产物要求同时测定原形药物和代谢产物检测宽线性范围

4、(CmaxCmax的1/20)、高灵敏度(10-9g/ml)和高专属性(分离能力)(原形药物及其代谢产物的分离)方法不必强调方法的简便、快速，大多采用色谱及其脱线或在线联用技术，如HPLC、LC-MS第四章 分析方法的建立与验证第一节 分析方法的设计依据8/6/20228体内药物分析二、分析测定的目的与要求临床治疗药物监测 有效治疗浓度范围内药物浓度方法尽量简便、易行；适用于长期、批量样品的测定，大多采用UV、RIA或EIA等。中毒患者的临床抢救 药物浓度极高方法不必强调方法的灵敏度，强调方法的特异性和分析速度大多采用色谱及其联用技术GC、GC-MS、RIA或EIA第四章 分析方法的建立与验证

5、第一节 分析方法的设计依据8/6/20229体内药物分析三、生物样品的类型与预处理方法生物样品的类型与预处理方法决定分析方法的应用以血浆或血清为分析样品采用蛋白沉淀-溶剂萃取预处理技术分析样品较为“干净”，可用HPLC检测用RIA分析样品的预处理方法可较为粗放经过简单的蛋白沉淀或不经任何预处理直接测定第四章 分析方法的建立与验证第一节 分析方法的设计依据8/6/202210体内药物分析四、实验室条件在设计体内药物分析方法时，还应充分考虑到实验室现有的或有可能在其它实验室使用的仪器装备，合理选择可行的分析方法。第四章 分析方法的建立与验证第一节 分析方法的设计依据8/6/202211体内药物分析

6、第二节 分析方法建立的一般步骤 一、分析方法的选择二、分析方法的建立(一)检测条件的筛选(二) 分离条件的筛选第四章 分析方法的建立与验证8/6/202212体内药物分析一、分析方法的选择体内药物分析方法的设计生物样品中的药物浓度决定分析方法的首要因素生物样品中药物或其特定代谢产物的浓度低、样品量少难以通过增加取样量提高方法灵敏度通过选择适当的分析方法适应样品分析需求 体内药物分析中常用分析方法特点见表4-1第四章 分析方法的建立与验证第二节 分析方法的建立步骤8/6/202213体内药物分析二、分析方法的建立分析方法建立之前查阅文献资料充分了解药物在体内的动力学过程 避免受到代谢产物的干扰，

7、选择适用于实际生物样品测定的方法第四章 分析方法的建立与验证第二节 分析方法的建立步骤8/6/202214体内药物分析8/6/202215体内药物分析8/6/202216体内药物分析8/6/202217体内药物分析8/6/202218体内药物分析Medline8/6/202219体内药物分析8/6/202220体内药物分析8/6/202221体内药物分析二、分析方法的建立初步拟定分析方法后进行一系列试验工作选择最佳分析条件同时验证分析方法的可行性确认是否适用于实际生物样品分析方法的建立和验证过程是不可截然划分的分析方法的建立步骤第一步：检测条件的筛选第二步：分离条件的筛选第四章 分析方法的建立

8、与验证第二节 分析方法的建立步骤8/6/202222体内药物分析(一)检测条件的筛选标准物质 照拟定的分析方法(不包括生物基质的预处理)测定 确定最佳分析检测条件(如色谱条件)和检测灵敏度HPLC 调整检测器(类型、条件) 、色谱柱(型号、牌号、填料性状与粒经、柱长度)、流动相(组分及其配比)及其流速、柱温、进样量、内标物质的浓度及其加入量等 使各物质具有足够的方法灵敏度(LOQ) 良好的色谱参数(n、R、T) 适当的保留时间(tR)第四章 分析方法的建立与验证第二节 分析方法的建立步骤8/6/202223体内药物分析(二)分离条件的筛选在进行分离条件筛选时，应考察生物基质中的内源性物质及代谢

9、产物对分离与检测的干扰，步骤如下：1空白溶剂试验 溶剂(方法特异性)2空白生物基质试验 (方法特异性)3模拟生物样品试验 方法效能指标4实际生物样品测试 代谢产物(方法特异性)第四章 分析方法的建立与验证第二节 分析方法的建立步骤8/6/202224体内药物分析1空白溶剂试验待测药物的非生物基质溶液（通常为水溶液）采用拟定的分析方法进行衍生化反应、萃取分离等 样品预处理（反应试剂、衍生化试剂、萃取溶剂等）测定响应信号（如HPLC峰面积或峰高）考察目标方法的特异性空白值应尽可能小，并能有效校正第四章 分析方法的建立与验证第二节 分析方法的建立步骤8/6/202225体内药物分析对色谱分析法而言可

10、通过改变反应条件、萃取方法或萃取条件（萃取溶剂的极性、混合溶剂的配比，固相萃取填料性质、冲洗剂与洗脱剂及其用量等），甚至检测器类型空白试剂信号应不干扰药物的测定（如R1.5） 本步骤主要考察需经化学反应的预处理过程，若预处理过程仅为生物样品的提取分离，则可不进行该步骤，直接进行空白生物基质试验 第四章 分析方法的建立与验证第二节 分析方法的建立步骤8/6/202226体内药物分析2. 空白生物基质试验空白生物基质 (blank biological matrix)如空白血浆照 “空白溶剂试验” 项下方法操作考察目标生物基质中内源性物质对测定的干扰（方法特异性）在待测药物(或特定的活性代谢物、内

11、标物质等)的“信号窗” 内不应出现内源性物质信号第四章 分析方法的建立与验证第二节 分析方法的建立步骤8/6/202227体内药物分析8/6/202228体内药物分析8/6/202229体内药物分析3. 模拟生物样品试验 模拟生物样品(质量控制,QC样品)空白生物基质中加入待测药物，照 “空白溶剂试验” 项下方法操作考察目标：方法的线性范围、精密度与准确度、灵敏度药物的萃取回收率等各项技术指标 同时进一步检验生物基质中内源性物质以及可能共同使用的其他药物对测定的干扰程度，即方法特异性第四章 分析方法的建立与验证第二节 分析方法的建立步骤8/6/202230体内药物分析对色谱分析法而言进一步考察

12、待测药物(或内标物)与内源性物质(或其它药物)的分离情况色谱峰的 tR、n 和 T 是否与水溶液的一致 色谱峰是否为单一成分（如何确定？） 标准曲线的截距是否显著偏离零点等内源性物质是否对待测药物或内标物质构成干扰第四章 分析方法的建立与验证第二节 分析方法的建立步骤8/6/202231体内药物分析Blank plasma8/6/202232体内药物分析Blank plasma spiked with St. and IS8/6/202233体内药物分析8/6/202234体内药物分析4. 实际生物样品的测试空白生物基质和模拟生物样品试验确定的分析方法及其条件不能完全确认是否适合于实际生物样品

13、的测定药物在体内可能与内源性物质结合(如血浆蛋白结合物)或代谢生成数个代谢产物及其进一步的结合物(或缀合物)实际生物样品确立分析方法后，尚需进行实际生物样品的测试考察目标：代谢产物对药物、内标物质的干扰情况进一步验证方法的可行性第四章 分析方法的建立与验证第二节 分析方法的建立步骤8/6/202235体内药物分析an extracted plasma sample from a healthysubject (6 h after oral administration of orphenadrine)8/6/202236体内药物分析8/6/202237体内药物分析8/6/202238体内药物分

14、析8/6/202239体内药物分析8/6/202240体内药物分析8/6/202241体内药物分析8/6/202242体内药物分析8/6/202243体内药物分析第三节 分析方法验证的内容与要求 基于以下原因需要对建立的分析方法学进行验证：1、生物样品量少2、浓度低3、内源性物质的干扰4、生物的个体差异较大8/6/202244体内药物分析用于实际生物样品分析之前：需要验证 (validation) 分析方法的可行性与可靠性方法验证时应考虑影响分析方法的所有可变因素： 采样、样品制备、色谱分离、检测与数据评价使用的技术指标效能指标使用的样品通常采用模拟生物样品和用药后的实际生物样品第四章 分析方

15、法的建立与验证8/6/202245体内药物分析验证步骤首先为分析方法的验证特异性、精密度与准确度、回收率、定量限与检测限、溶液稳定性其次为生物基质中待测药物稳定性的验证室温放置、冷冻（或冷藏）、冻-融循环 Freeze-and-thaw cycle第四章 分析方法的建立与验证第三节 分析方法的验证与要求8/6/202246体内药物分析验证的效能指标与基本要求1特异性（专属性）避免干扰2标准曲线与线性范围覆盖所有浓度范围3准确度与实际状况相符4精密度结果可重现5定量限达到峰浓度的1/101/206稳定性确保所有样品准确测定7提取回收率确保准确度第四章 分析方法的建立与验证第三节 分析方法的验证与

16、要求8/6/202247体内药物分析一、方法特异性(专属性或选择性)方法的特异性(specificity)又称专属性或专一性，通常与选择性(selectivity)互用系指当有内源性物质存在时，方法准确测定待测物质的能力专属性表示所检测的信号(响应)系属于待测药物所特有选择性系指将待测物质与其代谢物及同服的其它药物加以区分(分离)的能力特异性函盖二者，以验证所测定的物质与待测药物的同一性 考察一个分析方法是否具有特异性，应着重考虑以下几点：第四章 分析方法的建立与验证第三节 分析方法的验证与要求8/6/202248体内药物分析1. 内源性物质的干扰比较待测药物或其活性代谢产物检测信号 对照品（

17、或标准品） 空白生物基质 模拟生物样品（空白生物基质中添加对照品）如HPLC色谱峰的 tR、n 和 T 是否一致 及与内源性物质色谱峰的 R确证内源性物质对分析方法有无干扰第四章 分析方法的建立与验证第三节 分析方法的验证与要求8/6/202249体内药物分析2. 代谢产物的干扰 比较模拟生物样品和用药后的实际生物样品的检测信号与代谢产物的 R如HPLC色谱峰的 tR、n 和 T 或改变色谱条件(色谱柱)再比较来确证其它代谢产物对分析方法有无干扰结构已知的特定活性代谢物的测定通过HPLC-DAD和LC-MS确证色谱峰的单纯性和同一性对于结构未知的代谢产物的测定采用LC-LC-NMR进行结构的初

18、步推测后，考察其干扰情况第四章 分析方法的建立与验证第三节 分析方法的验证与要求8/6/202250体内药物分析3. 联合药物的干扰TDM时 还要考虑患者可能同时服用药物的干扰 通过比较待测药物及可能同时服用药物的模拟生物样品的检测信号如HPLC色谱峰的 tR、n 和 T 是否一致来确证同时服用药物对分析方法的干扰情况第四章 分析方法的建立与验证第三节 分析方法的验证与要求8/6/202251体内药物分析4. 与参比方法的相关性 除上述方法外，有时还可使用参比方法对照参比方法一般选用特异性强、准确度高、线性关系良好的色谱法，如在TDM中使用UV(或RIA)时, 可以HPLC(或GC)为参比 参

19、比方法测定结果为横坐标(X); 拟定方法结果为纵坐标(Y)用最小二乘法计算回归方程 YabX (坐标标度相等)、相关系数(r)表示两种方法测得结果的一致性，若 r 1，表示拟定方法为非线性，如 RIA 中抗血清滴度选择不当第四章 分析方法的建立与验证第三节 分析方法的验证与要求8/6/202252体内药物分析4. 与参比方法的相关性YabX 截距(a) 表示拟定方法受到恒定干扰的程度内源性物质(UV)斜率(b) 表示拟定方法受到比例干扰的程度标记抗原不纯(RIA)与参比方法的相关性比较除显示分析方法的特异性外斜率b表示两种方法测得结果的一致性若参比方法准确度良好，且截距a0, 则拟定方法的准确

20、度(回收率)为100b(%)第四章 分析方法的建立与验证第三节 分析方法的验证与要求8/6/202253体内药物分析二、标准曲线与线性范围标准曲线（standard curve） calibration curve or working curve生物样品中所测定药物浓度与响应的相关性（比例的程度）通常用回归分析方法所得的回归方程来评价除少数方法（免疫分析法）外，标准曲线通常为线性模式回归分析法为最小二乘法（least squares）或加权最小二乘法（weighted least squares）线性范围（linear rang）标准曲线的最高与最低浓度的区间模拟生物样品的测定结果应达到试验

21、要求的精密度和准确度第四章 分析方法的建立与验证第三节 分析方法的验证与要求8/6/202254体内药物分析二、标准曲线与线性范围(续)标准曲线用模拟生物样品建立线性范围(不包括零点)应能覆盖全部生物样品中的药物浓度不能使用外推的方法求算未知生物样品中的药物浓度建立标准曲线所使用的模拟生物样品应使用与待测的含药生物样品相同的生物基质制备第四章 分析方法的建立与验证第三节 分析方法的验证与要求8/6/202255体内药物分析标准曲线的一般建立方法 标准系列溶液的制备内标溶液的制备标准系列模拟生物样品的制备标准曲线的绘制加权最小二乘法限度要求8/6/202256体内药物分析标准曲线的一般建立方法

22、1. 标准系列溶液的制备 标准物质对照品、标准品溶剂水或甲醇（或其他适当溶剂）浓度模拟生物样品中药物浓度的50倍以上 加入量为生物样品总体积的2%以下 避免标准模拟生物样品与实际样品存在较大差异浓度较低应除去溶剂后再加入生物基质 否则,在实际样品测定时应加入等体积的溶剂并涡旋混匀 第四章 分析方法的建立与验证第三节 分析方法的验证与要求8/6/202257体内药物分析至少含58个浓度点(不包括零点,即空白)可覆盖全部待测生物样品中的药物浓度如：1、2、5、10、20、50、100(等比梯度模式比例常数约为 2)若体内平均达峰浓度为50，其1/20为2.5设定最高浓度为100，最低浓度为1 (个

23、体差异)第四章 分析方法的建立与验证第三节 分析方法的验证与要求8/6/202258体内药物分析2、内标溶液的制备内标物质对照品、标准品或化学试剂适宜的溶剂甲醇、水、乙腈或混合溶剂浓度与标准系列溶液的中间浓度相当如：某标准溶液5、10、20、40、80、160、320 g/ml，则内标的浓度应配制成40 g/ml8/6/202259体内药物分析3. 标准系列模拟生物样品的制备 空白生物基质(如血浆)加入标准系列溶液适量，涡旋混匀为防止在标准溶液加入及涡旋混合时造成的损失先加入标准溶液 再加入空白生物基质涡旋混匀 第四章 分析方法的建立与验证第三节 分析方法的验证与要求8/6/202260体内药

24、物分析实验中的注意事项：1、标准模拟生物样品的最高浓度应高于生物体用药后的达峰浓度，最低浓度应低于最高浓度的105。2、应先在离心试管中加入标准溶液，再加入空白生物基质后混悬3、标准溶液加入到试管中后，应先挥干溶剂再加入空白生物基质。8/6/202261体内药物分析4. 标准曲线的绘制以待测药物的检测响应(如色谱峰面积或峰高) 或与内标物质的检测响应的比值(内标法)(因变量, y )对模拟血药浓度 (自变量,x)求得回归方程( yabx )及其相关系数( )在一组由至少7个浓度(不包括零点)构成的标准曲线中，至多可有2个浓度点数据，可予剔除。但应有确切原因，如：（1）样品处理有损失；（2）色谱

25、图有问题；（3）显著偏离标准曲线其余应有至少5个浓度点在标准曲线上第四章 分析方法的建立与验证第三节 分析方法的验证与要求8/6/202262体内药物分析5. 加权最小二乘法 普通最小二乘法每个浓度点绝对误差(yiyi)赋予同等的重要性 标准曲线上的高低浓度相差悬殊(范围达102)低浓度区的计算值相对误差过大，难以满足规定要求。加权最小二乘法回归计算时增加一个权重因子(w)各浓度的响应值与回归值的相对离差平方和达到最小 式中，wi为标准曲线上第i个浓度点的权重因子第四章 分析方法的建立与验证第三节 分析方法的验证与要求8/6/202263体内药物分析1）回归方程(y = a + b x)参数的

26、计算第四章 分析方法的建立与验证第三节 分析方法的验证与要求8/6/202264体内药物分析2）权重因子的选择加权赋予低浓度点以更大的权重在实际工作中的一般方法（1）当wi=1/(yi)2时，则（2）而yi与xi成正比（3）所以，令wi=1/(bxi)2=k/xi2 (通常取wi=1/C2)当高浓度点测量值的准确度下降过大低浓度点权重过大，降低低浓度点的权重，wi=k/xi第四章 分析方法的建立与验证第三节 分析方法的验证与要求8/6/202265体内药物分析标准曲线的限度要求药代动力学或生物利用度研究标准曲线至少包括5个浓度(通常为58个浓度,不包括零点)最高浓度应高于达峰浓度(Cmax)；

27、最低浓度应低于Cmax的10%5%，并应为方法的LOQ(非LOD)回归方程的截距应接近于零，b使之具有较高的灵敏度相关系数要求 0.99(色谱法)或0.98(生物学方法)若非线性，可分为高低两个浓度区间(每个区间不少于5个浓度)，分别加权回归如1、2、5、10、20和10、20、50、100、200第四章 分析方法的建立与验证第三节 分析方法的验证与要求8/6/202266体内药物分析三、准确度方法准确度(accuracy)系指用该方法测得的生物样品中待测药物的浓度与其真实浓度的接近程度应使用实际生物样品测定，但实际生物样品的浓度是未知的所以，通常使用模拟生物样品测定一般用相对回收率(rela

28、tive recovery，RR) 或 相对误差(relative error，RE)表示第四章 分析方法的建立与验证第三节 分析方法的验证与要求8/6/202267体内药物分析1. 测定法 取空白生物基质（如血浆）数份，照标准曲线项下方法操作，用标准曲线计算 在标准曲线范围内制备质控(quality control，QC)样品高(接近上限)、中、低(接近LOQ) 3个浓度每一浓度至少5个样本与随行的标准曲线同法测定、计算，每个样品分析测定1次 第四章 分析方法的建立与验证第三节 分析方法的验证与要求8/6/202268体内药物分析2. 结果计算与限度要求计算测定值M(measured)的平均

29、值与理论浓度(加入值)A(added)比值相对回收率相对误差限度要求相对回收率应在85%115% (LOQ附近80%120%)RE在15% (LOQ附近为20%)第四章 分析方法的建立与验证第三节 分析方法的验证与要求8/6/202269体内药物分析8/6/202270体内药物分析四、精密度方法精密度(precision )系指每次测定结果与多次测定的平均值的偏离程度表示该分析方法的可重复性(reproducibility)反映分析方法的可操作性，是方法验证的基本要点之一实际生物样品的量有限(如血浆，一般为0.52ml)使用模拟生物样品测定 第四章 分析方法的建立与验证第三节 分析方法的验证与

30、要求8/6/202271体内药物分析1. 表示方法方法精密度一般用标准偏差(standard deviation，SD)或相对标准偏差(relative standard deviation，RSD)表示 SD=RSD= =批内(within-run或intra-assay)RSD日内(within-day)批间(between-run或inter-assay)RSD日间(between-day，day-to-day)第四章 分析方法的建立与验证第三节 分析方法的验证与要求8/6/202272体内药物分析2. 测定法分别测定法()照准确度项下方法，取空白生物基质(如血浆)数份，分别在同一批内和

31、不同批间制备高、中、低 3个浓度的QC样品，并分析测定批内RSD每一浓度56个样品，每个样品测定1次，用随行标准曲线分别计算3个浓度及每1浓度的RSD批间RSD每1分析批内每一浓度制备1个样品，每个样品测定1次；用随行标准曲线计算3个浓度(每一浓度56个分析批数据)的RSD第四章 分析方法的建立与验证第三节 分析方法的验证与要求8/6/202273体内药物分析2. 测定法连续测定法()若实际样品测定所用的分析批次少于5批，也可进行3个批次的连续分析(每1浓度的每1批次为56个样本)方差分析法 批间RSD =批内RSD = =第四章 分析方法的建立与验证第三节 分析方法的验证与要求8/6/202

32、274体内药物分析3. 限度要求在药代动力学和生物利用度研究中对g/ml级水平的RSD一般应10%ng/ml级水平的RSD一般应15%在LOQ附近RSD应20%。 第四章 分析方法的建立与验证第三节 分析方法的验证与要求8/6/202275体内药物分析8/6/202276体内药物分析五、定量限方法定量限(limit of quantitation，LOQ)系指在保证具有一定可靠性(准确度与精密度符合要求)的前提下，能测定出生物样品中药物的最低浓度,又称为方法灵敏度(sensitivity)标准曲线上的最低浓度点(最低浓度点LOQ)要求应能满足测定35个消除半衰期后生物样品中的药物浓度或Cmax

33、的105)准确度在80%120%(或RE在20%的范围内)RSD20%第四章 分析方法的建立与验证第三节 分析方法的验证与要求8/6/202277体内药物分析最低检测限（limit of detection LOD）：是指可在噪音水平下识别样品中药物的最低浓度，一般认为信噪比（S/N）3，信号可被检测，故以S/N）3时的样品浓度作为LOD. LOQ的检测信号至少是LOD的2倍以上，以（S/N）10作为LOQ的估计值。8/6/202278体内药物分析LOD TestS/N38/6/202279体内药物分析六、稳定性在生物样品的分析中，需要对样品的存放条件和时间进行考察，以保证分析结果的准确、可靠

34、 方法稳定性考察 生物样品的稳定性考察 相关稳定性的测定方法与要求8/6/202280体内药物分析方法稳定性：主要考察待测药物的标准品溶液在实验室温度、湿度、光照及空气等条件下的稳定性 在分析方法的建立时要考虑模拟生物样品的预处理及待测物在室温或冰箱中存放的稳定性8/6/202281体内药物分析生物样品的稳定性短期稳定性主要考察模拟生物样品在室温、4或20以及冻融循环条件下的稳定性长期稳定性主要考察生物样品长期冰冻（20 或80）后的稳定性8/6/202282体内药物分析测定方法与要求1、取高、中、低三个浓度的QC样品，在不同条件下存放不同时间后，每个样品重复测定三次，平均值应为零时测定的5以

35、内（经衍生化处理15以内）。若考察时间大于1天，则应与新制QC样品比较，若考察时间很长，可与反复在液氮中保存的样品在相同条件下的测定值比较2、稳定性期限要求室温下1个工作日（1、2、4、8、24）冰箱中数个工作日（数星期、数月）8/6/202283体内药物分析七、萃取回收率生物样品的预处理方法（1）方法准确度(或相对回收率，relative recovery)，操作简便、快速（2）萃取回收率(绝对回收率，absolute recovery)，70%萃取回收率与相对回收率的比较（1）萃取回收率主要考察生物样品预处理过程造成的药物的程度损失（2）相对回收率主要用来考察测定方法的准确度，采用标准曲线

36、可准确计算生物样品中药物浓度第四章 分析方法的建立与验证第三节 分析方法的验证与要求8/6/202284体内药物分析1. 测定法取空白生物基质(如血浆)，制备高、中、低3个浓度的QC样品(每一浓度至少5个样品)，每个样品分析测定1次另取等量的相同3个浓度的标准溶液，用溶解模拟生物样品经提取处理后的残渣的溶剂稀释至同体积，同法测定AT经萃取后的QC样品的检测信号或比值(内标法)AS未经萃取的标准溶液的检测信号或比值(内标法)第四章 分析方法的建立与验证第三节 分析方法的验证与要求8/6/202285体内药物分析实验过程中的注意事项1、要考察是内源性物质还是提取方法对提取回收率产生影响2、如采用内

37、标法定量时，内标应在提取之后，溶剂蒸发之前加入3、采用内标法定量时，应同时测定内标物质的提取回收率，只需配制一个中间浓度的QC样品5份8/6/202286体内药物分析2. 限度要求在生物利用度或TDM时高、中、低浓度样品的萃取回收率一般应50%高、中浓度的RSD应15%低浓度的RSD应20%内标法中内标物质的提取回收率应50%（RSD 15%) 第四章 分析方法的建立与验证第三节 分析方法的验证与要求8/6/202287体内药物分析8/6/202288体内药物分析八、质量控制该内容主要目的是用来在实际生物样品的测定过程中对分析数据的质量进行监控1、质控样品（Quality control QC

38、）：是指将已知量的待测药物加入到空白生物基质中配制的模拟生物样品，用于整个分析过程中的质量控制，一般配制高、中、低三个浓度的样品 质控样品池由不负责生物样品测试的人员在实验开始时制备，并与实际生物样品在相同条件下储存8/6/202289体内药物分析2、质量控制（1）测定法：在测定过程中，每批生物样品都应建立随行的标准曲线，并随行间隔以高低或低高测定高、中、低至少3个浓度的6个QC样品（2）限度要求：6个QC样品中至少4个的测定结果的准确度在各自正常浓度80120，RSD 20%,允许由2个QC样品超出各自的208/6/202290体内药物分析九、生物样品测定中其它需要注意的事情1、干扰性内源性

39、物质的排除方法2、测定方法的再评价或交互验证3、实际生物样品浓度超出线性范围的处理8/6/202291体内药物分析合适的空白生物基质的制备方法：1、对生物基质进行处理2、使用不含内源性物质的生物基质3、使用替代基质8/6/202292体内药物分析方法的再评价或交叉验证：1、改变色谱条件或生物样品的处理方法样品的前处理方法改变后需要对效能指标进行重新考察2、改变生物基质不同物种的生物基质进行同一药物的PK实验时，需要进行方法的再评价8/6/202293体内药物分析实际浓度超出标准曲线的处理：1、浓度高于定量上限取样品用空白基质稀释，同时制备高于定量上限的QC样品，同法稀释2、浓度低于LOQ增加生

40、物样品的体积，应在相同条件下制备QC样品和增加体积后的空白生物基质进行试验，以确认方法的准确度、精密度和特异性符合要求。8/6/202294体内药物分析第四节 体内药物分析方法应用示例第三代喹诺酮类广谱抗菌药盐酸环丙沙星片人体生物等效性研究一、文献调研在水中溶解，在甲醇中微溶，在乙醇中极微溶解，在氯仿中几乎不溶，在氢氧化钠试液中易溶；环丙沙星游离体在水中不溶，在乙醇、二氯甲烷中极微溶解，在稀醋酸中溶解。 第四章 分析方法的建立与验证8/6/202295体内药物分析药动学参数吸收过程空腹口服后吸收迅速、人体生物利用度约为49%70%Cmax 口服500mg后平均Cmax为2.42.6mg/LTm

41、ax 12hT1/2 血中T1/2约为4h，肾功能减退时稍有延长至6h蛋白结合率0%40%代谢口服给药24h内，40%50%原形、15%代谢物经肾排出第四章 分析方法的建立与验证第三节 分析方法的验证与要求8/6/202296体内药物分析体内分析方法RP-HPLC色谱柱ODS色谱柱流动相甲醇(乙腈)-磷酸(枸橼酸)缓冲液(三乙胺调节pH2.33.5)，或离子对色谱: 溴化十六烷基三甲基铵(氢氧化四丁基铵)检测紫外或荧光检测生物样品预处理蛋白沉淀法甲醇、乙腈或高氯酸沉淀蛋白后直接进样溶剂萃取法二氯甲烷-异丙醇、氯仿-异丙醇混合溶剂蛋白沉淀-溶剂萃取乙腈沉淀蛋白后二氯甲烷-异丙醇提取 第四章 分析

42、方法的建立与验证第三节 分析方法的验证与要求8/6/202297体内药物分析二、分析方法设计1分析方法血浆蛋白结合率低(20%40%)、以原形从肾排泄生物等效性研究测定血浆中环丙沙星原形药物的浓度-时间曲线。初步拟定：采用RP-HPLC法2检测方法紫外灵敏度1ng，若取血浆0.5ml，采用3倍量乙腈沉淀蛋白，取上清液100l进样，则要求血浆中环丙沙星浓度在50ng/ml以上，当Cmax在2g/ml以上(口服500mg)时基本可满足生物等效性研究要求荧光灵敏度0.1ng，能满足本试验要求 第四章 分析方法的建立与验证第三节 分析方法的验证与要求8/6/202298体内药物分析3样品制备方法初步拟

43、定采用简便、快速的乙腈沉淀蛋白后取上清液直接进样分析预试含75%乙腈的提取液100l进样后，色谱峰理论板数、对称性下降(前沿峰)，进而导致检测灵敏度降低(峰高降低)经进一步试验，确定为：血浆0.5ml乙腈1ml沉淀蛋白二氯甲烷-异丙醇(95:5)5ml萃取60氮气流吹干流动相200l溶解20l进样灵敏度可达2ng/ml(血浆浓度)，符合要求(Cmax2g/ml) 第四章 分析方法的建立与验证第三节 分析方法的验证与要求8/6/202299体内药物分析三、实验方案1给药方案 20名受试者随机分为两组，每组10人第1次试验第一组口服受试制剂(相当于环丙沙星500mg)，第二组口服相同剂量的参比制剂

44、第2次试验第1次服药后第7天开始，两组交换给药第四章 分析方法的建立与验证第三节 分析方法的验证与要求8/6/2022100体内药物分析2血样的采集与处理分别口服给药前和给药后0.25、0.5、1.0、1.5(tmax)、2.0、3.0、4.0、6.0、8.0、12.0和24.0(57个t1/2)小时由肘正中静脉取血 4 ml立即移入经肝素处理的离心试管中，静置5分钟后，离心15分钟(3000rpm)，分离血浆，-20冰箱中保存待测第四章 分析方法的建立与验证第三节 分析方法的验证与要求8/6/2022101体内药物分析3血样分析法色谱条件高效液相色谱仪(包括LC-10ATvp泵，RF-530

45、荧光检测器)；色谱柱为Kromasil ODS-AP(200mm4.6 mm，5m)流动相为乙腈-0.025mol/L磷酸溶液(86:14)，流速1.0ml/min检测波长为ex=277nm，em=445nm柱温为40。 第四章 分析方法的建立与验证第三节 分析方法的验证与要求8/6/2022102体内药物分析3血样分析法血浆样品的预处理取血浆0.5ml，加内标溶液(10g/ml诺氟沙星甲醇溶液）50 l、乙腈1.0ml，涡旋混合30s，离心5min，取上清液1ml，加二氯甲烷-异丙醇(95:5)混合溶剂5ml，涡旋振荡1min，离心5min，弃去上层水相，吸取下层有机相，60下氮气流吹干，残

46、渣加流动相200l，涡旋溶解30s，离心5min，取上清液20l进样 第四章 分析方法的建立与验证第三节 分析方法的验证与要求8/6/2022103体内药物分析四、分析方法验证1方法特异性环丙沙星峰tR=12.4min，诺氟沙星(内标物质)tR=10.9min，各峰均获得完全分离，内源性物质峰(与空白血浆样品一致)tR=8.6min对测定无干扰。志愿者用药后的血浆样品色谱图中环丙沙星与内标物质峰与模拟血浆样品中环丙沙星与内标物质峰的tR、T、n和R均一致，峰形相同。故不认为代谢物有干扰第四章 分析方法的建立与验证第三节 分析方法的验证与要求8/6/2022104体内药物分析2标准曲线标准系列溶

47、液取盐酸环丙沙星，加水制成1、2、5、10、20和50g/ml的标准系列溶液，冰箱保存标准系列模拟血浆样品取空白血浆0.5ml，加环丙沙星标准系列溶液各50l，配制成相当于浓度为0.1，0.2、0.5、1.0、2.0、5.0 g/ml的QC样品，冰冻(-20)测定法取QC样品，照“血浆样品的预处理”项下方法操作，以环丙沙星浓度C为横坐标，环丙沙星与内标物质的峰面积比值Y为纵坐标，用加权最小二乘法经Excel运算，求得的直线回归方程为：Y=1.33C-0.02583，R2=0.9951(C=0.15.0 g/ml)第四章 分析方法的建立与验证第三节 分析方法的验证与要求8/6/2022105体内

48、药物分析3方法精密度与准确度QC样品浓度为 0.1、0.5 和 2.0 g/ml分析批次3批，每批 5 样品测得浓度0.0988、0.4537 和 2.128 g/ml准确度RE(%)-1.2%、-9.3% 和 6.4%精密度批内(%)6.7%、4.6% 和 3.9%批间(%)8.9%、9.6% 和 12.3%第四章 分析方法的建立与验证第三节 分析方法的验证与要求8/6/2022106体内药物分析4方法定量限受试制剂和参比制剂的Cmax分别为3.2020.496和3.3000.730 g/ml方法的LOQ为0.1 g/ml 0.16 g/ml (Cmax的1/20)准确度和精密度均符合要求：

49、RE为-1.2% 日内RSD为 6.7% 日间RSD为 8.9%8/6/2022107体内药物分析第四章 分析方法的建立与验证第三节 分析方法的验证与要求表4-2 血浆中环丙沙星HPLC测定法的准确度与精密度考察结果分析批次加入量（ng/ml）100.0500.020001100.8457.12179.6 95.7451.02212.1105.4438.02084.9105.1447.12129.3104.3449.02190.1106.4469.42135.22 96.9465.72168.1 98.5497.92192.6 95.7468.12207.1105.9487.82251.3 9

50、5.8456.82252.2 86.3456.82240.93 97.6450.71911.6103.8446.91993.0 99.5436.62115.7105.3427.51990.5 82.4416.21847.1 93.7443.72203.6N181818（ng/ml）98.8453.72128.0SD 6.8 19.7 118.7RE（%）-1.2 -9.3 6.4批内RSD（%） 6.7 4.6 3.9批间RSD（%） 8.9 9.6 12.3表4-2 血浆中环丙沙星HPLC测定法的准确度与精密度考察结果分析批次加入量（ng/ml）100.0500.020001100.8457

51、.12179.6 95.7451.02212.1105.4438.02084.9105.1447.12129.3104.3449.02190.1106.4469.42135.22 96.9465.72168.1 98.5497.92192.6 95.7468.12207.1105.9487.82251.3 95.8456.82252.2 86.3456.82240.93 97.6450.71911.6103.8446.91993.0 99.5436.62115.7105.3427.51990.5 82.4416.21847.1 93.7443.72203.6N181818（ng/ml）98.8453.72128.0SD 6.8 19.7 118.7RE（%）-1.2 -9.3 6.4批内RSD（%） 6.7 4.6 3.9批间RSD（%） 8.9 9.6 12.3血浆冰冻血浆冻融残渣冷藏室温放置时间（d）As/Ai循环次As/Ai时间（d）As/Ai时间（h）As/Ai02.728604.359502.989203.4263102.911314.490212.978183.4350202.781924.313923.0595243.4