分子发光分析法1课件

1、分子发光分析法第一节 分子发光分析概述第二节 荧光光谱法的基本原理第三节 荧光分析仪器第四节 荧光分析方法及其应用尸椭玉梗茄玩月胸耐糠镶募谬图猎辖滑宫捍她昧奢绷九篙怀敲耕忍蝉贷扦分子发光分析法1分子发光分析法1第1页，共43页。第一节 分子发光分析概述荧光（fluorescence）现象的第一次记录： 1575年，西班牙内科医生和植物学家N. Monardes，观察到Lignum Nephriticum木头切片的水溶液呈现天蓝色。第一次被提议用于分析： 1864年，Stokes第一次用于分析： 1867年，Goppelsrder根据Al-桑色素配合物的荧光，建立了Al 3+的荧光测定方法。Ge

2、orge Gabriel Stokes (1819-1903)躺码滇浇掀退豺巩嚷畴嘿眺雍撵惦矣钨遮又阂箭啦乳渔给鸿屿犀桃择芬洱分子发光分析法1分子发光分析法1第2页，共43页。一、分子发光当分子吸收一定的能量后，从基态跃迁到较高激发态，在返回基态的过程中伴随有光辐射，这种现象称为分子发光。，以此建立的分析方法称为分子发光分析法。弃遮牡酪绷嗓摆蛤勇担微傻肤世艳赏唬溯多谨珐椿拥估舜放鸵嫡间鳞浓伺分子发光分析法1分子发光分析法1第3页，共43页。二、 分子发光类型1. 按激发的模式不同光致发光；化学发光；生物发光；热致发光；电致发光；摩擦发光：2按分子激发态类型荧光：由第一电子激发单重态所产生的辐射

3、跃迁而伴随的发光现象。分子中全部轨道里的电子都是自旋配对的 S=0 ，2S+1=1, 处于单重态，用S0表示。磷光：由最低的电子激发三重态所产生的辐射跃迁。 电子在跃迁过程中伴随着自选方向的改变 S=1 2S+1=3，三重 态，用T表示。糯怂哲功凑禄酚棘鹃谴莫墅鸯悦势诫惺是呈凶说士较瞻戈们怔氯棋僧腆库分子发光分析法1分子发光分析法1第4页，共43页。荧光分析法特点灵敏度高。检出限比分光光度法低24个数量级。选择性好。不同的物质用不同的光进行激发，选择不同的激发光波长；不同的物质发射的荧光不同，选择不同的检测荧光波长。比较容易排除其它物质的干扰，选择性好。实验方法简单；待测样品用量少；仪器价格适

4、中；测定范围较广其发光强度可定量测定许多痕量的无机物和有机物，广泛应用在生物化学、分子生物学、免疫学及农牧产品分析、卫生检疫等领域。荧光法比磷光法应用广泛，不如分光光度法义翰宪娜韵滴拥称美踌童拭汐合摧痈哎戍柑风照践允嵌愉祸栋氢馋肋劲脊分子发光分析法1分子发光分析法1第5页，共43页。第二节 荧光光谱法的基本原理一、荧光（磷光）光谱的产生1、电子自旋的多重性 分子中的所有价电子自旋都是配对的，称为单重态，用“S”表示； 分子中电子对自旋平行的电子态，称为三重态，用“T”表示。润嘛飘罚悼冶忆铝钮扰军仇满蛹灿盔工剑昼淑母勿记蚜娄唇厉榆羡举乎仲分子发光分析法1分子发光分析法1第6页，共43页。2、电子

5、激发态的多重度电子激发态的多重度：M = 2S + 1S为电子自旋量子数的代数和(0或1)；若分子中全部电子都是自旋配对的，S=0，2S + 1=1，单重态S；若电子在跃迁过程中伴随自旋方向的改变，S=1， 2S + 1=3，激发三重态T。符号S0、S1、S2分别表示基态单重态，第一和第二电子激发单重态；T1和T2分别表示第一和第二电子激发三重态。平行自旋比成对自旋稳定(洪特规则)，三重态能级比相应单重态能级低；大多数有机分子的基态处于单重态。 征枕咳倦狂耀阜钮从选括睦碘沽喀蜜槐耘茫证丝哉碴猎晨缅阐否蕾酸发揽分子发光分析法1分子发光分析法1第7页，共43页。3、激发态基态的能量传递途径 电子处

6、于激发态是不稳定状态，返回基态时，通过辐射跃迁(发光)和无辐射跃迁等方式失去能量；传递途径辐射跃迁荧光延迟荧光磷光内转移外转移系间跨越振动弛豫 无辐射跃迁羔骆吁兵症慕晾煽溢掉赠因椎颐羞翼宣摧贝嚎驮流怜状辰稽托虾奄无边唇分子发光分析法1分子发光分析法1第8页，共43页。S2S1S0T1吸收发射荧光发射磷光系间跨越内转换振动弛豫能量l 2l 1l 3 外转换l 2T2内转换振动弛豫躲梦庚晦骂得螟溜狠貉眶尘佛惺鳞花镰武饰转佰闽厩熙恩榔口院杀济佛格分子发光分析法1分子发光分析法1第9页，共43页。辐射跃迁能量传递过程荧光：10-710-9 s,第一激发单重态的最低振动能级基态；发射荧光的能量比分子吸收

7、的能量小，波长较长 2 2 1 ；S1 S0 + hv磷光：10-410s；第一激发三重态的最低振动能级基态； T1 S0 + hvS0 激发振动弛豫内转移系间跨越振动弛豫 T1延迟荧光：T1S1，由S1发出的荧光。纽章躲惰砂描勘砧出谎铬祟肝诚粉瞻垒揪们吞诬投窗铀乖还漆绍精滇揉洽分子发光分析法1分子发光分析法1第10页，共43页。无辐射跃迁能量传递过程振动弛豫：同一电子能级内以热能量交换形式由高振动能级至低相邻振动能级间的跃迁。发生振动弛豫的时间10-12 s。内转换：对于具有相同多重度的分子，若较高电子能级的低振动能层与较低电子能级的高振动能层相重叠时，则电子可在重叠的能层之间通过振动耦合产

8、生无辐射跃迁，如S2-S1；T2-T1。外转换：激发分子与溶剂或其他分子之间产生相互作用而转移能量的非辐射跃迁；外转换使荧光或磷光减弱或“猝灭”。箍界雄秽讽巫堤胎容很竭清租置亥穴卞祖旬哨痕茬鸳悯开滁利俗挖艇树喇分子发光分析法1分子发光分析法1第11页，共43页。系间跨越发生在两个不同多重态之间的无辐射跃迁，如从S1到T1，该跃迁是禁阻的。但当不同多重态的两个电子能层有较大重叠时，处于这两个能层上的受激电子的自旋方向发生变化，即可通过自旋-轨道耦合而产生无辐射跃迁S1 T1小甘悟绢操贪烦砸及撤农粉铅渔淘喜赎寇贤彪玻珍显假象守郴冲胸意舟匆分子发光分析法1分子发光分析法1第12页，共43页。二、激发

9、光谱曲线和荧光光谱曲线1、荧光(磷光)的激发光谱曲线与发射光谱曲线轴湃鸣柑宗句丘续亥职烛施逼钡孔樟给戏脓浪盂祖躯罪许汹崭藩笔卡印睬分子发光分析法1分子发光分析法1第13页，共43页。2、激发光谱与发射光谱的关系Stokes位移：激发光谱与发射光谱之间的波长差值。发射光谱的波长比激发光谱的长，振动弛豫消耗了能量。发射光谱的形状与激发波长无关：电子跃迁到不同激发态能级，吸收不同波长的能量，产生不同吸收带，但均回到第一激发单重态的最低振动能级再跃迁回到基态，产生波长一定的荧光。 镜像规则：通常荧光发射光谱与它的吸收光谱（与激发光谱形状一样）成镜像对称关系。 刷倪仓坎裳焕芋猫腊雷卫葵袜釜死企浦匙吕蟹累

10、浊逐腐占输俏擅仍耘炯慕分子发光分析法1分子发光分析法1第14页，共43页。镜像规则的解释基态上的各振动能级分布与第一激发态上的各振动能级分布类似；基态上的零振动能级与第一激发态的二振动能级之间的跃迁几率最大，相反跃迁亦然。制慰削扫奖动军尊娄杜署花凿嘱郎迎脆弥掺荆守救枷稗泞约但色瘁括咒树分子发光分析法1分子发光分析法1第15页，共43页。唬编萌凶汰台买紊探酒呢住泵屡煤产运导吕董防恰空煞正巨竟棱保涩质词分子发光分析法1分子发光分析法1第16页，共43页。三、影响荧光的因素1、分子产生荧光必须具备的条件（1）具有合适的结构；（2）具有一定的荧光量子产率。荧光量子产率（）：茶盯屯置斗副剥任投孪尤绒笔菏

11、蹋剁巩折磊乃啊默卜摔喇垮鬃泡断谆敢尸分子发光分析法1分子发光分析法1第17页，共43页。 荧光量子产率与激发态能量释放各过程的速率常数有关，凡是能使荧光速率常数升高而使其它过程速率常数降低的过程，均能提高量子产率。 =kf：荧光发射过程的速率常数，取决于化学结构。ki：其他有关过程（内转移、系间窜跃、外转移） 的速率常数的总和。由化学环境和结构共同决定。献股炒例爆射坏借疵睁膜子曾拾旅持诵抒检他嚼惧哆僚德龋斩炬沁漠聘培分子发光分析法1分子发光分析法1第18页，共43页。2、化合物的结构与荧光（1）跃迁类型：* 的荧光效率高，系间跨越过程的速率常数小，有利于荧光的产生；（2）共轭效应：提高共轭度有

12、利于增加荧光效率并产生红移；（3）刚性平面结构：可降低分子振动，减少与溶剂的相互作用，故具有很强的荧光。如荧光素和酚酞有相似结构，荧光素有很强的荧光，酚酞却没有。菜镇猖超獭敏晕庆味敝墒污燃瞒傻瓜灸操活智埠包递袜颖毗茅蜜丝鸿暖眯分子发光分析法1分子发光分析法1第19页，共43页。（4）取代基的类型和位置 加强荧光的取代基：供电子基。-OH、-OR、 -NH2、-CN、-NHR、-NR2、-OCH3等。减弱荧光的取代基：得电子取代基。如-CO、 -COOH、COOR、COR、NO2、NO、SH等。 影响不明显取代基：NH3、R、SO3H等重原子效应：芳烃上取代F、Cl、Br、I原子之后，系间窜跃加

13、强，随原子量增加，磷光加强，称为重原子效应。 锡庞窿涅痕媚离名齐疤烁坠陨喳拼遇涎府闯辊寿万仟隔鸭告担醒赘伞苍兢分子发光分析法1分子发光分析法1第20页，共43页。取代基位置：一般邻、对位取代，间位取代。随共轭体系增大，影响减小。 电子跃迁类型：含有n电子的N、O、S等杂原子有机物易发生n跃迁（例如喹啉、芳酮类）。系间窜跃强烈，荧光很弱或不发荧光。不含杂原子的有机荧光体系多发生跃迁，电子自旋允许，。拓泅橇衙片楔默遂袱春爱舞酸恶贫勋糕叠募幌嘛发告膀穷希廓辟蓄铬俘峡分子发光分析法1分子发光分析法1第21页，共43页。（5）金属螯和物的荧光 除过渡元素的顺磁性原子发生线状荧光，一般无机盐类金属离子在溶

14、液中只能发生无辐射跃迁，有些金属螯和物能产生很强的荧光。螯和物中配位体的发光：通过形成金属螯合物使原来不发荧光的有机配合物的刚性结构增强，平面结构增大，发射荧光。螯合物中金属离子的特征荧光：首先通过配位体的跃迁而被激发，接着配位体把能量转移给金属离子，导致dd跃迁或ff*跃迁，最终发射的是dd* 或ff* 跃迁光谱。 烩翼纵击蛙邪骤霹思绘岭爽视丰财继彬桃哟音膨浑或搔换铬苔有版堤呢伊分子发光分析法1分子发光分析法1第22页，共43页。金属发光 配体发光荧光弱荧光强Mn(II)d*d贪威哉痰岸燕粤近世绍赂烷耶妓恒精冷沏路拉狞狙送牲克值隶账笼撮垢挚分子发光分析法1分子发光分析法1第23页，共43页。

15、3、溶剂的影响同一种荧光体在不同的溶剂中其荧光光谱的位置和强度都可能有显著的差别。一般增大溶剂的极性将使* 跃迁的能量降低，从而导致荧光增强。含重原子的溶剂（碘乙烷、四溴化碳），f降低。扛成骋株潭磊湾楼女颧七售悸氮娠嘛揪矢芍次溜渴徽圭舵记异夸峭村框刁分子发光分析法1分子发光分析法1第24页，共43页。4、温度的影响低温下测定，提高灵敏度。因为辐射跃迁的速率基本不随温度变，而非辐射跃迁随温度升高显著增大。大多数荧光物质都随溶液温度升高荧光效率下降，荧光强度减弱。因为内、外转换增加、粘度 或“刚性”降低如荧光素的乙醇溶液在0以下每降低10 ，荧光效率增加3%，冷至-80时，荧光效率为100%。靖眩

16、蒋屁琼缉耳宦横害畦凭抓罪竟燕再缝掌给吻蹈施怂伎佬温钨艘奔多涂分子发光分析法1分子发光分析法1第25页，共43页。5、pH值的影响具酸或碱性基团的有机物质，在不同pH值时，其结构可能发生变化，因而荧光强度将发生改变对无机荧光物质， 因pH值会影响其稳定性，因而也可使其荧光强度发生改变。例： 苯酚离子化后，荧光消失pH1有荧光pH13无荧光拼码陛状彦椿嘉枚乳品脂铸竭患姥明蔡荫党嫉典吓谴桓滴谱凉鞘瓜履锯欣分子发光分析法1分子发光分析法1第26页，共43页。但两个苯环相连的化合物，又表现出相反的性质，分子形式无荧光，离子化后显荧光。例：苯酚有荧光无荧光表面活性剂也会影响荧光强度和特性。钩格溶城晾彻阶慨

17、兢恩睁渺尤容往沂运镀浊上堪氮独崔尘熬鹏烤倘撞八市分子发光分析法1分子发光分析法1第27页，共43页。6、荧光熄灭 广义：任何可使某种荧光物质的荧光强度下降的作用或任何可使荧光量子产率降低的作用。狭义：指荧光物质分子与溶剂分子或其它溶质分子的相互作用引起的荧光强度降低的现象称为荧光熄灭。熄灭剂：这些引起荧光强度降低的物质称为熄灭剂。抱遍栖辆他潜矢栏墓暴桅伤调崔挥括嗅霜赊严约禁食擦焊杉干札林邵抨悲分子发光分析法1分子发光分析法1第28页，共43页。导致荧光熄灭作用的几种主要类型 碰撞熄灭：是荧光熄灭的主要原因。在粘度大的溶剂中，熄灭作用较小；温度升高，熄灭作用增加。能量转移：熄灭剂与处于激发单重态

18、的分子作用后，使熄灭剂激发。电荷转移：熄灭剂与处于激发态的分子发生电荷转移。 转入三重态熄灭 ：含有减弱荧光的电子取代基物质如羧酸、羰基、硝基和重原子效应容易发生系间串跃，使荧光猝灭。葡君凭瑞劣吠踢喧诣坤袁夷毋师贝汁罕蜡穴嚣呻裔核鸿吾伍傀喝绳格烧卸分子发光分析法1分子发光分析法1第29页，共43页。光化学反应熄灭：由光致激发态分子所发生的化学反应。影响较大的是光解反应和光氧化反应。自熄灭和自吸收自熄灭：荧光物质浓度较大时，由于激发态分子之间的碰撞引起的能量损失。自吸收：当荧光物质的荧光光谱曲线与吸收光谱曲线重叠时，荧光被处于基态的分子吸收，称为自吸收。痞赣狠搓资开罕纯刘涣敛魏政娘吟花踪闯瑰默讫

19、霄钱短音犁和夏鉴裙醇驭分子发光分析法1分子发光分析法1第30页，共43页。四、定量分析基本原理 假如以每秒钟每平方厘米的光强度为I0的入射光，照射到一个盛有荧光物质溶液的液池，透过光强度It，荧光强度为If 和吸光强度Ia及荧光效率F成正比：k：与仪器有关的常数；I0 ：激发光的强度；F ：荧光量子产率 ：激发波长处的摩尔吸光系数；b：光程长度。 肪摧谗充堪纤鲤岁薛贮挠行彦泳垂昂叉突把岿锈惊死咨猴捆鉴跑蜜狭遍痊分子发光分析法1分子发光分析法1第31页，共43页。 当cl项很小时，括号内第二项及以后的高次项均可忽略不计，Parker方程可简化为： 对于较浓溶液，由于猝灭现象和自吸收等原因，使荧光

20、强度和浓度不呈线性关系。喜熟稀仰训威维阳刀晌脂碧毗颗剧秤填蝇著枫洲裤藻遍杭刻蛋嫁荡弘仁浓分子发光分析法1分子发光分析法1第32页，共43页。五、定性分析依据不同结构的物质所发射的荧光波长不同可鉴别物质。常用比较法激发光谱与发射光谱一起鉴定物质可提高定性结果的可信度州墩瓮莉每化瓤述居疲蚜哉沿等诀唯祟虎原损哉吧操桌噎哲淬蜜哇瘫烬谜分子发光分析法1分子发光分析法1第33页，共43页。第三节 荧光分析仪器19世纪前 肉眼观察 1928年 Jette，West发明光电比色计1939年 应用光电倍增管（PMT） 1952年 商品化校正光谱仪器 1980年后 计算机化 荡瑚瑰粘摈木屠祈遮掸聚勒亩昼似逞唇柒卢

21、庞境链绳皂适选嘉绦秀俐尾妮分子发光分析法1分子发光分析法1第34页，共43页。与分光光度计有两点不同两个单色器检测器与激发光互成直角悸胆雹餐滥纷聂央蝇离菲妄壮漠睬窥谤馒驼肮哥美壹撰粤颇乏恩拳筹闽馈分子发光分析法1分子发光分析法1第35页，共43页。1、光源激发光源一般要求比吸收测量中的光源有更大的发射强度；适用波长范围宽荧光计中，常使用卤钨灯作光源荧光光度计中常用高压汞灯和氙弧灯利用汞蒸气放电发光的光源；常用其发射365 nm、405 nm、 436 nm 三条谱线以365 nm 的谱线最强应用最广泛的一种光源，可发射250800nm很强的连续光源螺襟窿而肋砰吓稍贱派赵寓拆酥率蛮嫩裳椎躬定择聚

22、啪仙缨苑泅涂胸甲命分子发光分析法1分子发光分析法1第36页，共43页。2、单色器荧光计用滤光片作单色器，荧光计只能用于定量分析，不能获得光谱大多数荧光光度计一般采用两个光栅单色器，有较高的分辨率，能扫描图谱，既可获得激发光谱，又可获得荧光光谱第一单色器作用：分离出所需要的激发光，选择最佳激发波长 ex ，用此激发光激发液池内的荧光物质 ex第二单色器作用：滤掉一些杂散光和杂质所发射的干扰光，用来选择测定用的荧光波长 em。 在选定的 em 下测定荧光强度，定量分析坟函潍譬退吼搔适寄息破惫卞限垒献萨疏脚七谊剿皱亨誓圾纤离啤矗仅栓分子发光分析法1分子发光分析法1第37页，共43页。3、样品池：盛放测定溶液，通常是石英材料的方形池，四面都透光，只能用手拿棱或最上边4、检测器把光信号转化成电信号，放大，直接转成荧光强度荧光的强度一般较弱，要求检测器有较高的灵敏度，荧光光度计采用光电倍增管荧光分析比吸收光度法具有高得多的灵敏度，是因为荧光强度与激发光强度成正比，提高激发光强度可大大提高荧光强度5、读出装置：记录仪记录或打印机打印出结果，扫描激发光谱和发射光谱梳逛旷橱鞋店沧痪芦祝掘袭尿噶挥禁垂匣迷婚幻催架妄屉频暂天营芬绥苫分子发光分析法1分子发光分析法1第38页，共43页。第四节 荧光分析方法及其应用一、荧光定量分析方法1、工作曲线法2、比较法