白蛋白超负荷通过CHOP依赖途径引起肾小管上皮细胞凋亡研究课件

1、白蛋白超负荷通过CHOP依赖途径引起肾小管上皮细胞凋亡第1页，共35页。 肾间质纤维化是慢性肾病进展的共同途径，肾小管上皮细胞凋亡是慢性肾病肾小管间质纤维化的重要病理生理基础，其发生机制一直是肾脏病领域关注的重要科学问题。 蛋白尿是慢性肾病进展的独立危险因素。蛋白超负荷可诱导肾小管上皮细胞凋亡，细胞凋亡与肾间质纤维化呈显著正相关关系。但蛋白尿诱导肾小管上皮细胞凋亡的分子机制并未完全解析。研究背景第2页，共35页。内质网应激(Endoplasmic reticulum stress，ERS) ERS是一种进化保守的细胞应激反应，当细胞对内质网功能的需求超过其自身能力，出现错误折叠或未折叠蛋白质在

2、腔内聚集以及Ca2+平衡紊乱的状态,称为内质网应激。 ERS对决定应激细胞的结局如抵抗、适应、损伤或凋亡有重要作用。第3页，共35页。ERS双刃剑内源性保护机制重建正常ER功能细胞损伤、凋亡损伤效应内质网功能紊乱ERSERS诱发因素研究背景ER伴侣蛋白第4页，共35页。 PERK/Ire1 /CHOP途径 Ire1/TRAF2/Ask1/JNK途径 Caspase 12 /BCL-2 途径内质网凋亡途径研究背景CHOP是内质网源性转录因子，属C/EBP转录因子家族，广泛表达于哺乳动物细胞，ERS活化CHOP是细胞凋亡最重要的信号途径。 Bando Y,et al.FASEB,2004研究证实，

3、CHOP活化是多种损伤因素作用下平滑肌细胞，胰岛细胞以及肝脏细胞凋亡最重要的信号途径。 Chenf WP,et al.Cardiovasc Res,2008 Lawrence MC,et al.Prco Natl Acad Sci USA,2007 Ikeyama S,et al.L Biol Chem,2003第5页，共35页。蛋白尿未折叠蛋白反应PERK/CHOP途径ROS，胞浆Ca2+超载肾小管上皮细胞凋亡肾小管萎缩ERS？研究思路Q：第6页，共35页。技术路线体外实验研究HKCHKCDMEM对照白蛋白DMEM内质网伴侣蛋白GRP78表达内质网激酶PERK表达及磷酸化肾小管上皮细胞凋亡H

4、KCHKCCHOP SiRNAPERK SiRNA实效和量效关系内质网转录因子CHOP表达体内实验研究内质网伴侣蛋白GRP78，ORP150表达蛋白尿CKD患者（n 21）内质网转录因子CHOP表达肾小管上皮细胞凋亡肾组织非蛋白尿患者（n 7）科学问题？机制解析！第7页，共35页。入选患者基本情况1.750.27 #0.740.31血甘油三酯（mmol/L)6.800.85 #4.150.7726.775.60 #45.964.783.061.64 #0.070.04蛋白尿（g/24h）84.2910.4771.579.03血清肌酐（mol/L）886806舒张压（mmHg）12491167收

5、缩压（mmHg）3810419年龄（岁）10/114/3性别（男/女）CKD组（n=21）对照组（n=7）# p0.01,与对照组比较.血浆白蛋白（g/L）血总胆固醇（mmol/L）第19页实验结果第8页，共35页。（对照组）对照组pAdEasy-CUB组空载体组pAdEasy-ACUB组模型组 ORP150GRP78 CKD患者肾小管细胞ORP150、GRP78表达上调且随尿蛋白水平增加而增强（200），提示CKD患者肾小管细胞有ERS发生。对照组中度蛋白尿轻度蛋白尿重度蛋白尿对照组轻度蛋白尿重度蛋白尿中度蛋白尿研究结果第9页，共35页。（对照组）对照组pAdEasy-CUB组空载体组pAd

6、Easy-ACUB组模型组 CHOP凋亡细胞 CKD患者肾小管上皮细胞CHOP表达上调且发生核转位，细胞凋亡亦增加，且随尿蛋白水平增加而增强（200）对照组对照组重度蛋白尿轻度蛋白尿中度蛋白尿中度蛋白尿轻度蛋白尿重度蛋白尿研究结果第10页，共35页。*#*#*#*#*#*#*#*#研究结果*：P0.01,与正常对照组比较；#：P0.01,与轻度蛋白尿组比较；：P0.01.与中度蛋白尿组比较第11页，共35页。ORP150表达与24h尿蛋白量相关性分析GRP78表达与24h尿蛋白量相关性分析CHOP表达与24h尿蛋白量相关性分析细胞凋亡与24h尿蛋白量相关性分析研究结果第12页，共35页。CHO

7、P表达与肾小管上皮细胞凋亡相关性分析内质网源性转录因子CHOP表达与肾小管上皮细胞凋亡呈非常显著性正相关研究结果第13页，共35页。技术路线体内实验研究内质网伴侣蛋白GRP78，ORP150表达蛋白尿CKD患者（n 21）内质网转录因子CHOP表达肾小管上皮细胞凋亡肾组织非蛋白尿患者（n 7）科学问题？PERK SiRNA体外实验研究HKCHKCDMEM对照白蛋白DMEM 内质网伴侣蛋白GRP78表达内质网激酶PERK表达及磷酸化肾小管上皮细胞凋亡HKCHKCCHOP SiRNA实效和量效关系内质网转录因子CHOP表达机制解析！第14页，共35页。体外实验 白蛋白超负荷对肾小管上皮细胞GRP7

8、8、CHOP、 PERK表达，PERK磷酸化及细胞凋亡影响12 CHOP基因沉默对PERK表达和白蛋白诱导肾小管 上皮细胞凋亡的影响2 PERK基因沉默对CHOP表达和白蛋白诱导肾小管 上皮细胞凋亡的影响3第15页，共35页。GRP78、PERK、p-PERK及CHOP表达随白蛋白浓度的增加而上调，提示它们与白蛋白存在量效关系ActinGRP78 HSA (mg/ml ) 0 5 10 20CHOPActinTubulinPREKTubulinp PREK研究结果 Part1第16页，共35页。ActinGRP78CHOPActinTubulinPREKTubulinp-PREK研究结果 Pa

9、rt1 HSA (h) 0 6 12 24 36GRP78、PERK、p-PERK表达随白蛋白作用时间的延长在6h即上调，而CHOP表达则在12h才增加，提示它们与白蛋白存在时效关系，但是GRP78、PERK、P-PERK的表达上调要先于CHOP。第17页，共35页。HKC凋亡与白蛋白刺激具有量效关系2.15%0mg/ml5mg/ml7.70%10mg/ml15.52%20mg/ml25.82%研究结果 Part1第18页，共35页。随着白蛋白作用时间的延长，HKC凋亡在12h明显增加，提示HKC凋亡与白蛋白刺激具有时效关系0h1.58%6h1.79%12h16.04%39.15%36h24h

10、26.15%研究结果 Part1第19页，共35页。体外实验 白蛋白超负荷对肾小管上皮细胞GRP78、CHOP、 PERK表达，PERK磷酸化及细胞凋亡影响12 CHOP基因沉默对PERK表达和白蛋白诱导肾小管 上皮细胞凋亡的影响2 PERK基因沉默对CHOP表达和白蛋白诱导肾小管 上皮细胞凋亡的影响3第20页，共35页。CHOP基因沉默抑制HKC CHOP mRNA表达图 A: 扩增曲线 B：熔解曲线 AB*#研究结果 Part2*：P0.01， #：P0.05，与对照组比较；： P0.01，与HSA刺激组比较第21页，共35页。ControlcontrolsiRNACHOPsiRNAHSA

11、+CHOPsiRNAHSAActinCHOP *#*CHOP基因沉默抑制CHOP蛋白表达 *：P0.01， 与对照组比较； #：P0.01，与HSA刺激组比较 研究结果 Part2第22页，共35页。ControlcontrolsiRNACHOPsiRNAHSA+CHOPsiRNAHSAPERKTubulin *CHOP基因沉默对PERK表达无影响研究结果 Part2*：P0.01， 与对照组比较第23页，共35页。ControlcontrolsiRNACHOPsiRNAHSA+CHOPsiRNAHSAP-PERKTubulin *#CHOP基因沉默上调PERK磷酸化研究结果 Part2 *：

12、P0.01， 与对照组比较； #：P0.01，与HSA刺激组比较 第24页，共35页。对照组2.24%control siRNA2.39%CHOP siRNA2.45%CHOP siRNA+HSA15.76%HSA26.40%*#*：P0.01， 与对照组比较; #：P0.01 ，与HSA刺激组比较CHOP基因沉默抑制白蛋白超负荷诱导的HKC凋亡研究结果 Part2第25页，共35页。体外实验 白蛋白超负荷对肾小管上皮细胞GRP78、CHOP、 PERK表达，PERK磷酸化及细胞凋亡影响12 CHOP基因沉默对PERK表达和白蛋白诱导肾小管 上皮细胞凋亡的影响2 PERK基因沉默对CHOP表达

13、和白蛋白诱导肾小管 上皮细胞凋亡的影响3第26页，共35页。PERK基因沉默抑制HKC PERK mRNA表达图 A: 扩增曲线 B：熔解曲线BA*#*：P0.01， #：P0.05，与对照组比较；： P0.01，与HSA刺激组比较 研究结果 Part3第27页，共35页。PERK基因沉默抑制HKC CHOP mRNA表达图1 A: 扩增曲线 B：熔解曲线 AB图 A: 扩增曲线 B：熔解曲线#*研究结果 Part3*：P0.01， #：P0.05，与对照组比较；： P0.01，与HSA刺激组比较 第28页，共35页。ControlcontrolsiRNAPERKsiRNAHSA+PERKsi

14、RNAHSAActinCHOP #*PERK基因沉默抑制CHOP表达研究结果 Part3 *:P0.01,#:P0.05,与对照组比较；：P0.01，与HSA刺激组比较 第29页，共35页。ControlcontrolsiRNAPERKsiRNAHSA+PERKsiRNAHSAPERKTubulin *#*PERK基因沉默抑制PERK表达研究结果 Part3*:P0.01,#:P0.05,与对照组比较；：P0.01，与HSA刺激组比较 第30页，共35页。ControlcontrolsiRNAPERKsiRNAHSA+PERKsiRNAHSAP-PERKTubulin *#PERK基因沉默抑制

15、PERK磷酸化*：P0.01， 与对照组比较； #：P0.01，与HSA刺激组比较 研究结果 Part3第31页，共35页。第70页对照组2.29%control siRNA2.55%PERK siRNA2.41%PERK siRNA+HSA17.16%HSA25.16%*#*：P0.01， 与对照组比较; #：P0.01 ，与HSA刺激组比较PERK基因沉默抑制白蛋白超负荷诱导的HKC凋亡研究结果 Part3第32页，共35页。蛋白尿ERS(未折叠蛋白反应)p-PERKROS，胞浆Ca2+超载肾小管细胞凋亡肾小管萎缩结 论CHOP第33页，共35页。 蛋白尿可引发慢性肾病患者肾小管上皮细胞ERS，虽然ERS标志物GRP78和ORP150表达上调，但CHOP表达也显著增多，肾小管上皮细胞凋亡增加，提示蛋白尿