h定点突变与基因打靶技术解析课件

1、定点突变与基因打靶技术李冬民 博士 副教授Email：；西安交通大学医学部基础医学院生物化学与分子生物学系第1页，共85页。第一节 基因定点突变第2页，共85页。基因突变包括单个碱基或片断的替换，基因片断的插入与删除等。根据其特点可将基因突变技术分两大类： 1.随机突变 表型筛选 2.位点特异性突变 定点突变 I.基因突变第3页，共85页。点突变：指单个碱基的突变，简而言之突变发生在基因的一个点上，故称点突变点突变的类型 1）碱基替换 a.转换：同类碱基间 b.颠换：不同类型间的碱基 2）碱基的增加及缺失II.点突变第4页，共85页。点突变的分子效应： 突变发生在基因编码区 a.同义突变:由于

2、遗传密码有兼性，若突变的密码子编码同样的氨基酸一般对蛋白质的结构和功能没有影响 b.错义突变:碱基对的置换使mRNA的某一个密码子变成编码另一种氨基酸的密码子的突变II.点突变第5页，共85页。c.无义突变（nonsense mutation ）：是指由于某个碱基的改变使代表某种氨基酸的密码子突变为终止密码子，从而使肽链合成提前终止。 编码氨基酸的密码子突变为终止密码子，使肽链合成中断。 II.点突变 d.移码突变:在正常地DNA分子中,碱基缺失或增加非3地倍数,造成这位置之后的一系列编码发生移位错误的改变，这种现象称移码突变。 第6页，共85页。 1.定义：按照人们的意愿对基因的编码区和表达

3、调控区定向进行缺失、插入或碱基替换等过程。III.基因定点突变2.定点突变的研究意义：对调控区进行突变研究基因结构与功能之间的关系对编码基因进行突变检验特定残基在蛋白质结构、催化活性和配基结合能力中的作用获得突变蛋白第7页，共85页。3.定点突变的类型（1）寡核苷酸介导的基因突变指用含有突变碱基的寡聚核苷酸片断作为引物，在聚合酶的作用下启动DNA分子进行复制。（2）盒式突变是利用一段人工合成的含基因突变序列的寡核苷酸片段，取代野生型基因中的相应序列。（3）PCR介导的基因突变III.基因定点突变第8页，共85页。DNA定点突变的种类寡聚核苷酸介导替换、插入、删除盒式突变PCR介导第9页，共85

4、页。III.基因定点突变第10页，共85页。（1） 寡聚核苷酸介导法第11页，共85页。Kunkel法或称 “U” 法dut-：dUTP 酶缺陷，细胞不能把 dUTP 转化为 dUMP ，因此细胞内 dUTP 的含量大为增加，其中一些 dUTP 可掺入 DNA 中正常情况下由胸腺嘧啶占据的位置。背景介绍第12页，共85页。 在dut+的E. coli中 dUTP dUMP 在dUTP 酶缺失体中（dut- ） dUTP dUMP dUTP酶 dut：dUTPase突变，可导致E. coli内dUTP的量增加，当DNA复制时，可在很多应该加dTTP的位置加入dUTP。第13页，共85页。Kunk

5、el法或称 “U” 法ung-：UDG 酶缺陷， UDG 酶尿嘧啶（uracil）-N-糖基化酶（glycosylase）可除去掺入 DNA 中的尿嘧啶残基,产生脱碱基的位点。含有脱碱基的DNA链不再具备作为完整复制模板的能力背景介绍 制备单链DNA模板时用ung- dut-突变的大肠杆菌菌株如CJ236菌株，该菌株合成的DNA中部分胸腺嘧啶被尿嘧啶取代。如M13噬菌体DNA中有20-30个尿嘧啶第14页，共85页。 在正常情况下，尿嘧啶-糖基化酶(ung+)可以去除掺入DNA中的尿嘧啶残基。但在ung-的菌株中，此酶失活。 在大肠杆菌dut- ung-菌株中生长的M13噬菌体的单链基因组DN

6、A中将含有20-30个尿嘧啶残基。用这些噬菌体感染ung+菌株，尿嘧啶被迅速去除，DNA链遭到破坏，感染力下降约5个数量级。 此法的成功关键，是要得到好的含单链模板DNA。第15页，共85页。 目标 DNA 插入 phagemid 载体并进入 E.coli CJ236 。 由于该菌体 ung- dut- 突变，合成的 DNA 上含有少量尿嘧啶（取代胸腺嘧啶） M13K07 辅助感染下，产生带 U 的单链 DNA 。 与引入诱变的 Oligo 复性。Kunkel 法过程包括：第16页，共85页。 在 T7DNA polymerase 和 ligase 作用下，以带 U 的单链 DNA 为模板合成

7、一条新链，形成杂合双链。 感染 dut+ ung+ E.coliMV1190 后，在细胞分裂过程中，只有新合成的 DNA 链才能起模板作用合成新的并引入了诱变位点的子代双链 DNA 。而有 U 的 DNA 链，在 dut+ 和 ung+ 产物的作用下，尿嘧啶被水解，从而失去作为模板的能力。第17页，共85页。无5-3外切活性3-5外切活性低噬菌粒载体（phagemid ）M13K07辅助感染产生带 U 的单链 DNA 第18页，共85页。 这种方法得到的突变率太低，约为1-5%。主要原因是含突变位点的双链DNA，转入E.coli后，被其修复系统修复了。第19页，共85页。第20页，共85页。要

8、求 5 端磷酸化。引物的终极条件：与靶 DNA 正确配对特异性地与靶 DNA 序列退火。 引物第21页，共85页。A.单核苷酸置换插入或缺失5 端完全配对，使得上游（引物）起始的 DNA 合成不容易将诱变寡核苷酸取代，约需 8-10bp 。 3 端所形成的杂交体足以引导 DNA 合成。如果错配核苷酸太靠近 3 端， 3 端将不能形成稳定的杂交体，易被外切活性降解。所以 3 端需有 7-9bp 完全配对；为便于筛选，应选用可形成稳定杂交体而长度最短的诱变寡核苷酸。一般 17-19bp ，错配在中央，使得完全配对的杂交体与错配杂交体之间的热稳定性差异足够大。第22页，共85页。B.多处缺失或变换

9、2 个 bp 以上的 oligo 两侧需 12-15bp 侧翼双链区的 Tm 应约为 35-40Tm = 4 （G + C） + 2 （A + T） 突变区域大，效率越低（两侧形成稳定杂交体的能力是突变区长度的函数 越低）。靶 DNA 尽可能短，应测序确定其突变。 模板/结果第23页，共85页。2.盒式定点突变第24页，共85页。3. PCR介导的基因突变在基因5和3末端产生突变重叠延伸PCR大引物PCR法第25页，共85页。（1）在基因5和3末端产生突变第26页，共85页。（2）重叠延伸PCR诱变法（Overlap extension） 对于两个具有部分重叠序列的 DNA 片段，在经过变性和

10、复性后，两个 DNA 片段之间通过同源序列形成部分杂合的双链，在 DNA 聚合酶作用下，杂合双链可互为引物和模板，引导 DNA 的合成，从而形成杂合 DNA 双链。第27页，共85页。该方法需要4个引物,包括2个含有突变碱基的反向互补的引物,2个上、下游通用引物。整个诱变过程需要3个PCR反应分2轮进行。第1轮PCR的2个反应分别产生2个含突变位点的上下游DNA片段,这2个DNA片段的末端互补。第1轮PCR的产物需要经凝胶电泳纯化。第2轮PCR将上述2个PCR产物混合,通过末端互补配对互为引物延伸得到完整的含突变位点的全长DNA再用通用引物扩增诱变的全长的DNA第28页，共85页。重叠延伸法定

11、点突变技术的原理示意图第29页，共85页。第30页，共85页。重叠延伸PCR法小结缺点：需要2对引物，进行3次PCR，并且需要对中间产物进行纯化。优点：几乎没有特殊限制，而且成功率高，因此运用非常广泛。 同时利用重叠延伸PCR技术可以对基因中心区段进行取代、插入、缺失的突变。第31页，共85页。第32页，共85页。第33页，共85页。（3）大引物PCR诱变法 大引物PCR法由Kammann M等人于1989年提出,随后经Sarkar G和Sommer S S等人加以改进。 该方法需2个侧翼引物和1个内部诱变引物,经过2轮PCR获得突变的全长DNA。 第1轮PCR用诱变引物和1个侧翼引物,扩增产

12、物经凝胶纯化后作为大引物再与另一侧翼引物进行第2轮PCR,产生全长的突变的DNA。第34页，共85页。大引物PCR介导的定点突变原理第35页，共85页。 Picard V,1994和Song-Hua Ke,1997等分别建立了单管大引物PCR(Single-tube megaprimer PCR)。单管大引物法省去第1轮PCR产物的纯化过程,实现在同一管中先后进行两轮PCR反应。Song-Hua Ke提出的方案更加巧妙简单。 需设计Tm值不同的2个侧翼引物,第1轮PCR反应用低Tm值的侧翼引物(F1)和诱变引物,用较低的退火温度,扩增反应产生大引物。然后再加入高Tm值的侧翼引物(F2)在较高的

13、退火温度下进行第2轮的反应,扩增出全长的含突变位点的DNA产物。第36页，共85页。单管大引物PCR诱变第37页，共85页。*以PCR为基础的定点诱变技术存在的问题及解决对策1）.诱变产物的忠实性PCR产物有相对高的错误率,除目的突变外,常包含一些非预定突变。可以通过以下2个方法将错误率降到最低。限制扩增的循环数应用更好的热稳定DNA聚合酶,如Pfu,Vent等,它们具有35外切酶活性,并具有校正功能第38页，共85页。2）. 诱变的效率提高诱变效率是以PCR为基础的定点诱变面临的问题。通过PCR条件的优化、不同Tm值的引物的巧妙的设计、不对称扩增、把引物标记上生物素分离突变DNA等手段可以提

14、高诱变效率。PCR定点诱变方法的不断创新和发展使得分子生物学关于基因和蛋白质的结构与功能的基础研究和基因工程中定点改造目的基因更加简便、高效、低耗。第39页，共85页。* 各种点突变方法的比较方法寡聚核苷酸介导的突变盒式突变PCR介导的突变优点保真度高简单易行突变效率高操作简单突变成功率高缺点操作复杂周期长合成多条引物成本高受到酶切位点的限制后续工作复杂TaqDNA聚合酶保真性偏低第40页，共85页。应用产品一步反向PCR法Stratagen公司的QuikChange系列试剂盒SBS Genetech公司的Muta-direct Site Directed Mutagenesis KitStr

15、atagen公司的QuikChange Multi Site-Directed Mutagenesis KitTaKaRa公司的Multipoints Mutagenesis Kit 第41页，共85页。（1）一步反向PCR法第42页，共85页。一种简便快速的定点突变的方法 Stratagen公司研制的Quickchange试剂盒,可以双链DNA质粒为模板，只需一对引物，进行一次PCR，在12d内即可完成点突变过程。 DpnI识别序列为甲基化的GATC，GATC在几乎各种质粒中都会出现，而且不止一次。 （2）Dpn法第43页，共85页。 以反向PCR为基础,直接以含有目的基因的环状质粒为模板,

16、用2个反向的、5端相邻且磷酸化的引物向2个反方向延伸,扩增出线性的双链DNA,然后用Dpn酶降解甲基化或半甲基化(只含有1条模板链)的模板链（即来自质粒）,而在体外合成的突变链不受Dpn酶的降解,这样可以纯化突变的双链DNA。最后用连接酶连接形成带突变基因的环状质粒。第44页，共85页。第45页，共85页。Overview of the QuikChange XL site-directed mutagenesis method.第46页，共85页。QuickChange ，GeneTailor，Easy/Fast Mutagenesis System也是基于PCR原理实现点突变，但它们与传统

17、方法的区别主要在于可以对突变克隆进行初步的筛选筛选原理：降解甲基化质粒模板筛选依据： 来自大肠杆菌的质粒99%发生甲基化； PCR是去甲基化过程，PCR产物（发生突变的产物）是去甲基化的产物。QuickChange ，GeneTailor，Easy /Fast Mutagenesis System三种市售点突变试剂盒的比较第47页，共85页。筛选方法：体内降解：原始质粒模板可以被能降解甲基化质粒的大肠杆菌（DMT）降解，而去甲基化的扩增产物（发生突变的产物）不会被降解。体外降解：DpnI识别序列5-GmATC-3（在DNA序列中，一般每256bp中出现一次）。甲基化模板可被DpnI识别、切割，

18、而去甲基化的扩增产物（发生突变的产物）不会被降解。第48页，共85页。Stratagene：QuickChange Mutagenesis System优点：筛选方法：DpnI限制性内切酶缺点：引物完全重叠，线性扩增， 产物不可见，可操作性差扩增产物为线状无DMT体内消化降解模板第49页，共85页。Invitrogen：GeneTailor Mutagenesis System优点引物部分重叠，指数扩增扩增产物可见，易于操作筛选方法：DMT体内降解缺点：突变点在一条引物上无DpnI限制性内切酶降解模板第50页，共85页。TransGen： 综合了上述两种试剂盒的优点！引物部分重叠；优化两条引物

19、上均有突变点，突变效率高；DpnI体外降解筛选 + DMT体内降解筛选=双重筛选！第51页，共85页。TransGen:Easy/Fast Mutagenesis SystemEasy点突变与Fast点突变的区别Easy Mutagenesis System： 使用EasyPfu酶Fast Mutagenesis System： 使用FastPfu酶 扩增速度比Taq更快、保真性比Pfu更高，扩增10Kb左右的质粒只需2个小时！第52页，共85页。引物设计扩增特点模板降解方法StratageneQuickChange完全重叠突变位点位于两条引物上线性扩增，产物不可见产物为线状DpnI酶体外降解

20、InvitrogenGeneTailor部分重叠突变位点位于一条引物上指数扩增，产物可见产物为环状DMT细胞体内降解TransGenEasy/Fast Mutagenesis部分重叠突变位点位于两条引物上指数扩增，产物可见产物为环状DpnI酶体外降解DMT细胞体内降解第53页，共85页。Steps of Multipoints Mutagenesis Kit (TaKaRa) 适用于插入片段长度在1.0kb以下的多点突变。市售多位点突变试剂盒第54页，共85页。Steps of Muta-direct Site-Directed Mutagenesis Kit第55页，共85页。Overvie

21、w of the QuikChange Multi Site-Directed Mutagenesis method 资料表明，引入3个定点突变的效率为60%，5个定点突变的效率为30%。 第56页，共85页。第二节 基因打靶技术第57页，共85页。 基因打靶技术是一种定向改变生物活体遗传信息息的实验手段。通过对生物活体遗传信息的定向修饰（包括基因灭活、点突变引入、缺失突变、外源基因定位引入、染色体组大片段删除等），并使修饰后的遗传信息在生物活体内遗传，表达突变的性状，从而研究基因功能等生命科学的重大问题，以及提供相关的疾病治疗、新药筛选评价模型等。 基因打靶技术的概念第58页，共85页。基因

22、打靶（gene targeting）：是指通过DNA定 点同源重组，改变基因组中的某一特定基因，从 而在生物活体内研究此基因的功能。基因敲除（knock out of gene）：通过DNA同源重组， 使得胚胎干细胞特定的内源基因被破坏而造成其 功能丧失，然后通过ES细胞介导得到该基因丧失 的小鼠模型的过程称为基因敲除。基因敲入（knock in of gene）：利用基因同源重组， 将外源有功能的基因转入基因组中进行同源重 组，在细胞内获得表达。第59页，共85页。 进行基因打靶，首先要设计和合成一个将要导入靶细胞的靶载体。该载体不仅含有需要插入的DNA序列，其两端还含有与靶基因座上的序列相

23、同的核苷酸片段，即同源重组指导序列。将此载体导入靶细胞，通过外源载体和内源靶位点相同的核苷酸序列之间的同源重组，使外源DNA定点整合到靶细胞的特定的基因座上。因此，同源重组是基因打靶技术的分子生物学基础。 基因打靶技术的原理 第60页，共85页。 基因打靶技术的产生和发展建立在胚胎干细胞技术和同源重组技术成就的基础之上。 同源重组是指发生在减数分裂或者有丝分裂过程中，相同或者相似DNA序列间的重组。它通常通过一对同源分子非姐妹染色体间的断裂而产生新的重组片断。 干细胞是指一类具有无限分裂能力的细胞，他们能通过一次不对称分裂在复制自己的同时产生不同类型的细胞。胚胎干细胞是从着床前的哺乳类胎盘中分

24、离的全能干细胞，具有在体外不分化的增殖能力，经过长期体外培养后仍然具有分化成所有3种胚层的发育潜能。 第61页，共85页。 由于在真核细胞内发生同源重组的机率非常低，因此要把发生定点整合的细胞从大量随机整合的细胞中筛选出来，就成了基因打靶要解决的关键技术问题。 基因打靶筛选系统 第62页，共85页。1. 正向选择法： 正向选择法只适用于在靶细胞中能正常表达的基因。其原理是：构建一个特殊的载体，此载体所携带的正向选择标记基因本身没有自己的表达调控因子，而只能利用靶位点上相应的表达调控元件来启动表达，从而发挥选择标记的作用。根据所用的表达调控元件的不同，此法又可分为无启动子筛选法和无Poly(A)

25、筛选法。 第63页，共85页。2. 正负筛选法（positive and negative selection, PNS） 这是目前最为常用的方法。正负筛选法的基本方法是：构建一种特殊的载体，该载体含有一段与靶基因同源的序列，在这段序列的某一外显子中插入Neo基因作为正选择标记；在同源序列之外的3末端，或3，5两个末端接上单纯疱疹病毒的胸腺嘧啶激酶HSVTK基因的序列作为负筛选标记。经酶切后使载体线性化，然后导入细胞中，进行体外培养，并以药物G-418和GANC作双重筛选。 第64页，共85页。图2：正负选择载体的筛选原理：正负选择DNA；：染色体DNA；、之间斜线部分为同源区；A、B：染色体

26、上的两个基因 E：外源基因；neo：G418抗性基因，即正选择基因；HSK-TK：负选择基因第65页，共85页。3. PCR 筛选法 PCR法就是选择性地扩增发生同源重组的DNA片段。发生同源重组时，由于两个引物分别从相对的两个方向同时扩增，结果是DNA片段的拷贝数以指数形式增加，得到已知长度的DNA双链片段。与之相反的是，在随机整合中，由于只有一个引物且为单方向，所以扩增的片段拷贝数呈线性比例，片段为单链，长度不定。运用PCR法进行筛选时，必须对每个细胞克隆分别进行扩增，因此较为费时费力。 第66页，共85页。基因打靶的必备条件 1. 胚胎干细胞(ES细胞)：取自小鼠受精卵发育第4、5天的胚

27、泡细胞 。特点：能在体外培养，保留发育的全能性。 2.打靶载体Neo 阳性筛选标志： 新霉素抗性基因，neor基因插入用于打靶的外源DNA中（一个启动子缺失的正向选择基因 neo neomycin ），当重组后neo 基因也被插入到染色体，因此发生同源重组的ES细胞能在含G418的培养基中生长。（同源重组）HSV-tk阴性筛选标志：单纯疱疹病毒（herpes simplex virus）的胸腺嘧啶激酶（thymidine kinase）基因，该基因产物可分解单核苷酸类似物而生成毒性产物，产生自杀效果。 （鉴别非同源重组）第67页，共85页。 将HSV-tk基因插入外源基因外侧的载体序列中。当外

28、源DNA与细胞染色体上的同源序列发生同源重组时，载体部分(含HSV-tk基因)是不能被整合到染色体中的。 如果ES细胞在此种培养基中被杀死，说明含有HSV-tk基因载体部分插入基因组。可能发生非同源重组。 如果细胞能在含单核苷酸类似物的培养基上生长，说明含有HSV-tk基因载体部分没有重组到染色体中；可能发生同源重组。基因打靶的必备条件 第68页，共85页。随机整合同源重组第69页，共85页。（一）首先要获得并体外培养胚胎干细胞；（二）构建基因打靶载体：把目的基因及其调控序列等与内源靶序列同源的序列，都重组到带有标记基因的载体上；（三）用电穿孔或显微注射等方法将打靶载体（重组体）导入ES细胞；

29、（四）重组体转染的ES细胞的鉴定；基因敲除的基本程序第70页，共85页。（五）ES细胞胚胎移植和嵌合体杂交育种：通过显微注射或者胚胎融合的方法将经过遗传修饰的胚胎干细胞引入受体胚胎内，经过遗传修饰的胚胎干细胞仍然保持分化全能性，可以发育为嵌合体动物的生殖细胞。使得经过修饰的遗传信息经生殖系统遗传，最终获得的带有特定修饰的突变体动物为研究者提供了一个特殊的研究体系，可以在生物活体中研究特定基因的功能。基因敲除的基本程序第71页，共85页。基因敲除的基本程序1 、构建打靶载体 第72页，共85页。2. 将打靶载体导入ES细胞 选取发育第4-5天的胚胎干细胞(ES) ， 将打靶载体导入胚胎干细胞。通

30、过打靶载体上的目的基因的同源序列与染色体组上的待敲除基因发生重组置换，以载体上的neo基因置换ES细胞基因组的目的基因，从而得到丧失了目的基因的ES细胞（基因敲除细胞；同源重组）。一般多采用显微注射法将打靶载体导入ES细胞。并筛选打靶成功的阳性细胞基因敲除细胞。 第73页，共85页。3 、将基因敲除ES细胞注射入胚泡中，使其原胚泡中的细胞共同组成胚泡的内细胞团，形成嵌合胚胎。4 、将10-20个胚泡植入假孕小鼠子宫中。5 、嵌合体的杂交育种把胚胎注入假孕小鼠Southern印记把细胞注入胚泡第74页，共85页。6、杂和小鼠（+/-）间杂交，获得子二代小鼠 （+/+、-/-、+/-）。7、筛选的

31、-/-、+/-子二代小鼠。（+/-）（+/-）（+/-）（-/-）（+/+）（+/-）（+/-）（+/-）（+/-）（+/+）（-/-）第75页，共85页。图1:基因打靶流程图第76页，共85页。 基因打靶的效率可以用相对效率和绝对效率来表示。所谓绝对效率是指发生同源重组的细胞数与处理的细胞数之比；相对效率是指发生同源重组的细胞数与发生随机整合的细胞数之比。影响打靶效率的因素很多，归纳起来，主要有以下几种： 基因打靶效率的影响因素 1 同源片段来源及长度的影响 2 调控元件的影响 3 外源DNA导入方法的影响4 靶基因位点的影响第77页，共85页。1 基因功能和基础理论研究方面 新基因功能的研究是当前分子生物学蓬勃发展的一个重要领域。基因靶位操作技术通过定点改造基因组中特定基因，有可能在细胞水平上研究特定基因的功能和调控机制，从定点突变的干细胞获得突变基因型个体，而在生物体水平了解基因的胚胎发育和生理功能。定点突变细胞和基因突变型个体的获得，为阐明基因的功能提供了最直接的途径。 基因打靶技术的应