生命起源与进化：10核酶、脱氧核酶的分子进化

1、 第十章核酶、脱氧核酶的分子进化自然进化与人工分子进化的比较自然进化分子进化选择压环境靶分子选择方式自然选择强存弱汰亲和纯化选择对象表型肽、蛋白质 生命起源过程中，先有蛋白质，还是先有核酸？ 1 核酶（Ribozyme）概述剪接型核酶剪切型核酶脱氧核酶（deoxyribozyme)三链DNA核酶的应用对酶及生物催化剂的认识的发展一、概 述生物催化剂（Biocatalyst）蛋白质类：天然酶 enzyme 极端酶 extremozyme 抗体酶 abzyme 生物工程酶其它：模拟酶核酸类:克隆酶遗传修饰酶蛋白质工程新酶、RibozymeDeoxyribozyme长期以来，人们认为只有某些蛋白质才

2、有生物催化功能。但近些年研究发现，某些RNA分子也具有生物催化功能，被称为Ribozyme。1982年Cech等发现四膜虫细胞大核期间26SrRNA前体具有自我剪接功能，并于1986年证明其内含子L-19IVS具有多种催化功能。1984年Altman等发现RNaseP的核酸组分M1RNA具有该酶的活性，而该酶的蛋白质部分C5蛋白并无酶活性。Cech和Altman因发现Ribozyme而获得1989年度诺贝尔化学奖。核酶指一类具有生物催化功能的RNA。1981年美国科罗拉多大学Cech等发现四膜虫rRNA中I型内含子具有自我剪接功能。1983年Altman等发现单独RNA可催化tRNA前体为成熟

3、tRNA，具有RNase P活性。核酶的发现打破了只有蛋白质才可能有酶催化功能的概念。为此获得1989年度诺贝尔奖。 剪切型核酶剪接型核酶根据催化反应锤头核酶I型内含子II型内含子发夹核酶丁型肝炎病毒（HDV)核酶RNaseP核酶的分类Chambon等发现类内含子切割位点有2个特点（1）内含子的两个末端并不存在同源或互补。（2）连接点具有很短的保守序列，称为边界 顺序。其规律称为GT-AG法则（GT-AG rule) 或Chambon法则。 左边的剪接位点称供体位点（donor）， 右边的剪接位点称受体位点（acceptor）。边界顺序核酶的催化类型已发现的核酶有几十种。其中植物病毒、拟病毒、

4、卫星RNA均为以RNA为模板，以滚动环方式复制RNA，自我切割是其RNA生命周期中不可缺少一环。核酶分为催化分子内反应和分子间反应二大类。催化分子内反应核酶又可分为自我剪接（Self-splicing）和自我剪切（Self-cleavage）二类。内含子的自我剪接 四膜虫26S rRNA转录产物可在几秒钟内自动切除413nt内含子。G亲核攻击内含子剪接点，切开后外显子接在一起。放出的内含子自身环化。 分子间催化反应底物专一性 催化t-RNA加工 大肠杆菌RNase P是一种5端内切酶，催化生成成熟t-RNA。发现该酶由RNase P-蛋白质和RNase P-RNA组成。自体催化剪切 丁型肝炎病

5、毒（HDV）RNA自我剪切。箭头所指为剪切部位。链孢霉线粒体RNA自我剪切类病毒的自体剪切 环状220-400nt小分子RNA不编码蛋白，复制依赖宿主，为RNA到RNA途径，滚环状复制模式。环状类病毒进入宿主后，由正链类病毒转录出多个负链复制中间物。负链中间物自我剪切后环化，再转录出多个正链复制中间物。正链中间物剪切并环化后成为有感染性的类病毒。其剪切通过锤头状二级结构进行。二、剪接型核酶剪接型核酶的作用机制是通过既剪有接的方式除去内含子（Intron).剪接型核酶分类1、I类内含子2、II类内含子核酶是一种金属依赖酶金属离子的作用：1、特异的结构作用，或参与活性部位的 化学过程2、促进RNA

6、的总体折叠3、二价金属离子（如Mg 2+ ）与底物活性部位直接相互作用，参与过渡中间复合物的形成CCCUCUOP+HOG 3OAoooCCCUCUOPOAoO GCCCUCUOH+P-oGoAoo 过渡态CCCUCUOPOAoO GoCCCUCUOPOAoO GMg 2+Mg 2+o过渡态 金属离子催化UCUAAAIVSGUAAPre-rRNAUCU A AAGUAAUCUoH35GAAAGUAAUCUUAA5GAAAGOH 3 G-IVSL-19IVS19nt53rRNA535pGOH353四膜虫rRNA前体自我剪接反应1. I类内含子的自我剪接(Self-splicing)剪接机制L-19

7、IVS在体外的多种酶活性核酶是一种金属依赖酶结构与功能的关系 边界序列为5-UG-3 引导序列：IVS中的6个嘌呤核苷酸序列 5-CUCUCU-3 3-GGGAGG-5 G结合位点:IVS 中的 P7茎区 空间结构 类内含子二级结构通式保守序列G结合位点剪接部位引导序列 mRNA剪接过程 mRNA剪接反应是在剪接体（splicesome)上进行的. 5种snRNA 剪接体 50多蛋白质p 3 HO-Gp3 pP-GOHp P-G3HO 类内含子的剪接机制Mg 2+或Mn 2+GMP,GDP,GTP外显子 内含子或居间序列（Intervening sequence,IVS)52、类内含子的自我剪

8、接剪接机制结构与功能的关系1、转核苷酸作用 2CpCpCpCpC CpCpCpCpCpC +CpCpCpC2、水解作用 CpCpCpCpC CpCpCpC + pC3、转磷酸作用CpCpCpCpCpCp+UpCpU CpCpCpCpCpC + UpCpUp4、去磷酸作用 CpCpCpCpCp CpCpCpCpC +Pi5、限制性内切酶作用 CpUpCpUpN +G CpUpCpU +GpN 类内含子有一个保守的二级结构：边界序列为5-GUGCGYnAG-3结构域：两个保守内含子结构序列EBS1,EBS2与两个外显子结构序列IBS1,IBS2互相配对。结构域：高度保守，催化活性必需。结构域：A

9、提供2-OH 类内含子二级结构模式5 3p 2 HO-Ap p-A p3OHpP-AHO 3类内含子的剪接机制Mg 2+套环的形成53外显子连接三、剪切型核酶1、自身催化剪切型RNA剪切机制锤头结构 (Hammerhead)发夹结构(Hairpin)斧头结构(Axehead)假结样结构(Pseudoknot-like) 这类RNA进行自身催化的反应是只切不接。特点：在 Mg 2+ 或其他二价金属离子存在下，在特定的位点，自我剪切，产生5-OH 和2，3-环磷酸二酯末端。 剪 切 机 制核酶自身剪切反应锤头（Hammerhead)结构二级结构模型锤头二级结构编号锤头结构的类型锤头核酶的催化反应机

10、制锤头结构的 五种类型R示酶，S示底物，箭头示剪切位点锤头型核酶的二级结构 和空间立体结构示意图三个双螺旋区13个核苷酸残基保守序列剪切反应在右上方GUX序列的3端自动发生锤头状二级结构锤头状二级结构中有13个核苷酸保守序列，其中11个不变时剪切反应即可发生。17位（ X ）的核苷酸残基多数是C,不能是U,G.7位核苷酸残基的置换不会对酶活性产生很大影响锤头二级结构编号7位核苷酸17位核苷酸锤头型核酶对切割位点的识别位点遵守NHH规则（N代表任意核苷酸，H代表A,U或C）。催化过程需要二价金属离子参与。单金属离子催化双金属离子催化 发夹（hairpin ）结构 发夹核酶发现于三种不同植物RNA

11、病毒，即烟草环点病毒，菊苣黄色斑点病毒型和筷子芥花叶病毒。三种发夹核酶分别是这些RNA病毒卫星RNA的负链，英文缩写分别是sTRSV,sCYMVT,sARMV,均为单链RNA。 发夹核酶结构模型 发夹核酶催化机制 金属离子在催化反应 中起结构作用，其剪切活性比锤头结构核酶高。5个环和4个螺旋形成两个结构域剪切反应发生在底物识别序列GUC的5端两个内部环中的碱基及在螺旋区的G11和底物中的G+1都是酶发挥作用所必需的。53 发夹二级结构模型剪切位点HDV RNA斧头结构模式 三个碱基对的茎需要二价阳离子，产生5-OH和 2,3-环磷酸剪切部位剪切部位GUACGGCCGGUGCCGGCUGGGGC

12、AUUCCGAGGGGAC CAAGUAAUGGCUCCCCUGcCGGGUCCAGCCU U C C G C C UCAGGUAAGCG35剪切位点 HDV 核酶假结样结构L3L4J1/2 J1/4J2/4四个螺旋区，三个连接区，两个环活性中心区： J1/4, J2/4, L3剪切位点：688/6892、异体催化剪切型RNA 核糖核酸酶P(RNaseP)是内切核酸酶，是核糖核蛋白体复合物，能剪切所有tRNA前体的5端，除去多余的序列，形成3-OH 和 5-磷酸末端。 RNaseP由M1RNA和蛋白质亚基组成。体外： M1RNA具催化作用，蛋白质作为辅助因子 体内： M1RNA和蛋白质对酶活性

13、都是必需的。剪切机制: 依赖于Mg 2+结构与功能的关系：M1RNA 5端完整结构对维持催化活性是必需的。 RNaseP可剪切前体5端41nt, 5端成熟。不同tRNA的 5 端没有顺序共同性，剪切的准确性与剪切部位周围的核苷酸顺序无关，表明在RNaseP的组分内没有引导序列， RNaseP所识别的是底物的高级结构。RNaseP底物的二级结构剪切位点影响核酶活性的因素1、pH值对活性的影响 pH7.0 - 7.5 时核酶活性最高。2、二价金属阳离子对活性的影响Mg 2+ Mn 2+ 3、抗生素对活性的影响大多数为抑制效应4、变形剂对活性的影响5、温度对活性的影响在65范围内随温度升高而增加，3

14、7 时均有适宜的活性。四、脱氧核酶1、体外选择技术筛选脱氧核酶分子脱氧核酶分子的体外选择是通过优先扩增事先固定在固相载体上的具有自我裂解功能的活性分子来实现的。通过这一技术已有两种具有RNA裂解活性的脱氧核酶被筛选出来。2、脱氧核酶催化特征 10-23裂解位点为嘌呤、嘧啶连接双链稳定性越高，酶活性越高 结合臂的长度影响酶催化转换性 RNA-DNA 比 RNA-RNA 稳定性差。 对Mg 2+,Zn 2+,Ca 2+,Mn 2+有依赖性 组氨酸，精氨酸促进催化活性 极强的切割特异性（单碱基错配即可大幅降低切割活性）10-23型脱氧核酶作用机理RY RRNA substrate切割点R=A or

15、GY=C or Udeoxyribozyme 5 3手枪型脱氧核酶自我剪切作用机理茎II (催化部位)茎I(结合部位) 53 3 C A切割点102030 40BAA5BBABAPCRPCR555StreptavidinColumnNaOHcofactor体外选择技术筛选具有自我裂解功能的DNA分子N50(DNA分子库）五、三链DNA三链DNA在基因治疗中的意义寡聚脱氧核苷酸（ODN）以DNA双螺旋分子的专一性序列为靶子，通过与该序列形成三螺旋DNA来阻止转录作用机制合成脱氧寡核苷酸（ODN）（同聚嘌呤或同聚嘧啶）DNA分子中同聚嘌呤 同聚嘧啶ODN也被称为TFO(triplex-formin

16、g oligo)六、核酶的应用RNA干扰在医学领域中的应用作为高特异性RNA限制性内切酶生命起源探索RNA干扰（RNA interference, RNAi）是指在多种生物细胞内，由双链RNA（double-stranded RNA，dsRNA）介导同源序列mRNA的特异性降解，从而导致基因沉默（gene silencing）的现象。因RNAi所致的基因沉默发生在转录后水平，所以被称为转录后基因沉默（post-transcriptional gene silencing, PTGS）。RNAi现象广泛存在于大多数真核生物中，这种存在揭示了RNAi很可能是出现于生命进化的早期阶段。近年来，随着对

17、RNAi研究的不断深入，其作用机制正在逐步被阐明；同时作为阻断基因表达的新手段，RNAi技术也日趋完善和成熟。 核酶在医学领域中的应用：通过识别特定位点而抑制目标基因的表达，抑制效率高，专一性强。免疫源性低，很少引起免疫反应。针对锤头核酶而言，催化结构域小，既可作为转基因表达产物，也可以直接以人工合成的寡核苷酸形式在体内转运。在其他领域的应用防治动、植物 病毒侵害：马铃薯纺锤形块茎类病毒负链的多价核酶构建，马铃薯卷叶病毒复制酶基因负链的突变核酶的克隆等核酶在医学上的应用1、核酶抗肝炎病毒的研究 目前人们已进行了核酶抗甲型肝炎病毒（HAV)、乙型肝炎病毒（ HBV）、丙型肝炎病毒（ HCV）以及

18、HDV作用的研究。人工设计核酶多为锤头状结构，少部分是采用发夹状核酶。2、抗人类免疫缺陷病毒型（HIV- )核酶 1998年，美国加利福尼亚大学Wong-Staal等利用发夹核酶抑制HIV- 基因表达，并率先进入临床期。3、抗肿瘤治疗 核酶能在特定位点准确有效地识别和切割肿瘤细胞的mRNA,抑制肿瘤基因的表达，达到治疗肿瘤的目的。 基因治疗（gene therapy）向有功能缺陷的细胞补充相应功能基因，以纠正或补偿其基因缺陷，从而达到治疗的目的。对象： 体细胞 生殖细胞基因治疗的必要条件发病机制在DNA水平上已经清楚要转移的基因已经克隆分离，其表达产物有详尽的了解该基因正常表达的组织可在体外进

19、行遗传操作理想的基因治疗还必须：外源基因可有效导入靶细胞外源基因能在靶细胞中长期稳定存留导入基因能适量表达导入基因的方法及载体对宿主细胞安全无害基因治疗的主要策略基因标记(gene labeling)Neo基因，逆转录病毒载体基因置换（基因矫正）定位重组或同源重组纠正缺陷基因或异常序列基因添加（基因增补）导入外源基因使靶细胞表达其本身不表达的基因导入正常的基因补偿缺陷基因的功能导入新的基因，利用表达产物治疗基因干预(gene interference)指采用特定的方式抑制某个基因的表达，或者通过破坏某个基因而使之不表达，以达到治疗疾病的目的。(mRNA,DNA)导入寡核苷酸抑制内源基因的表达反

20、义核酸 封闭基因表达核酶 裂解特异的靶mRNA基因转移的方法：生物学方法逆转录病毒载体，腺病毒载体，腺病毒相关病毒载体，单纯疱疹病毒载体安全性问题：感染的可能性、污染的可能性、整合导致的基因突变非生物学方法脂质体直接注射受体介导基因转移技术其它方法(磷酸钙共沉淀法、电穿孔法、显微注射法、基因枪法)目前常用的靶细胞有：造血细胞皮肤成纤维细胞肝细胞血管内皮细胞淋巴细胞肌肉细胞肿瘤细胞反义RNA与特异的mRNA结合而调控其翻译安全性高反义RNA设计和制备方便具有剂量调节效应能直接作用于一些RNA病毒核酶应用的优势核酶结构稳定可重复使用核酶的设计 靶序列无二级结构切割位点GUN容易与其它RNA互补结合

21、核酶技术面临的问题1、核酶催化切割反应的可 逆性问题2、提高催化效率3、寻找合适载体将核酶高效、特异地导入靶细胞4、使核酶在细胞内有调控地高效表达5、增强核酶在细胞内的稳定性6、对宿主的损伤问题有待进一步考察 2 核酶的体外分子进化核酶的功能随机RNA库的构建新酶的体外选择一、核酶的功能与特定的蛋白质（病毒颗粒）结合RNA的拼接切割DNA连接酶的功能自身催化与生物素(biotin)连接酰基化反应磷酸激酶活性其他活性确定要进化的区域 类内含子二级结构保守序列G结合位点剪接部位引导序列类内含子二级结构5 317位（ X ）的核苷酸残基多数是C,不能是U,G.7位核苷酸残基的置换不会对酶活性产生很大影响锤头二级结构7位核苷酸17位核苷酸RNaseP底物的二级结构剪切位点二、随机RNA库的构建添加T7 promoter序列随机序列DNA库的构建体外转录体外筛选富集扩增GCCGGATCCGGGCCTCATGTCGAA - (Nt)nT7promoterPCR合成DNA随机DNA序列随机序列DNA库T7-promoter-PrimerPCR筛选特异RNA逆转录体外转录cDNA随机RNA多轮筛选富集提高R