关于抗菌材料的实验设计-杨茜

1、根据上海市第九人民医院院感科出示的细菌药敏检测报告，院内感染目前最常见的病原菌为：铜绿假单胞菌，鲍曼不动杆菌，肺炎克雷伯菌，金黄色葡萄球菌、白色念珠菌以及大肠杆菌。（按顺序，标本以痰液、分泌物以及血液为主）物理性能测试：力学性能测试：将干态和湿态的样品按GB/T634-1996切成标准样条，在美国Instron5567万能力学试验机上测定试样的拉伸强度。吸水率的测试、相对保湿率的测试：参照文献1。透气率的测试：参照文献2。孔隙形貌观察：将试样充分干燥后，在扫描电镜上观察海绵的孔隙结构，加速电压为10kV。表面形貌测试：扫描电镜测定（包括细菌被破坏前和破坏后的形态）细胞毒性测试：1、以成纤维细胞

2、测试方法一：选用L929小鼠成纤维细胞进行毒性试验：设置空白组，对照组，实验组。37C下，将材料分别浸没在培养基中过夜，种植细胞浓度为2.5x109L-1的L929细胞20pL（达到5x104细胞/孔），平行数为5,分别培养1,3,7,14d后将培养基小心地从培养板移除。用PBS冲洗3遍，每个孔加入400pL的培养基,然后在无光下再添加100pL的5g/L的MTT/PBS溶液。用铝箔将培养板裹紧，37C下孵化4h；用移液管移除培养基和MTT，每个孔添加200pL二甲基亚砜，混合几分钟；从每个孔移除100pL混合液，加入96孔板中；在490nm波长下，用ELISA对孔板的溶液进行检测，记录吸光度

3、值。方法二：选用L929小鼠成纤维细胞进行体外细胞毒性实验：细胞培养、传代与计数：传代培养48h后，弃去培养液，在生长旺盛的L929细胞加入0.25%胰蛋白酶（pH7.8）液于37C消化2.03.0min，弃去消化液，加入RPMI1640液以吸管反复吹打，使细胞分散均匀，制备成6x107L-1浓度细胞悬液。细胞形态观察及分析标准：将空白组（RPM11640培养液），实验组，对照组6.4%苯酚溶液）各3mL,分别置于35mm细胞培养皿内，加入6x107L-1浓度L929细胞悬液3mL,置于37C、体积分数为5%CO2、100%湿度的培养箱培养24h及72h，倒置相差显微镜观察细胞形态及生长情况，

4、细胞形态分析标准如下：细胞形态分析标准：毒性细胞形态无毒形态1E常，呈按形或不规则三角形，贴壁生长良好轻度贴壁生长好.可见少数细胞圆缩，偶见悬浮细胞中度贴壁生长不佳.细胞圆貓达1/3以上，见悬浮死细胞重度基本不贴壁，90%以上为悬浮死细胞注：MTT比色法：参照ISO10993.5-2009进行。具体步骤：将浓度为6x10/L-1的细胞悬液接种于96孔培养板，每孔100pL,置于37C、含体积分数为5%CO2培养箱内培养24h，观察细胞贴壁后弃原液，用PBS洗涤2次。将3板随机分为实验组、阴性对照组和阳性对照组，实验组加入受试材料浸提液，空白组（RPMI1640培养液），实验组，对照组（6.4%

5、苯酚溶液），每组10孔，每孔均为100pL。将处理后的96孔板置于37C、含体积分数为5%CO2培养箱中培养24,48,72h。于各观察点末期弃原培养液，加入20pLMTT(质量浓度为5g/L),37C、含体积分数为5%CO2孵育4h后终止培养。吸去上清液，每孔加入二甲基亚砜100ML,600r/min振荡10min，用酶标仪在490nm测定吸光度(A)值，记录结果。计算相对增殖率(relativegrowthrate,RGR)。进行显著性分析：采用SPSS13.0软件完成统计处理，实验数据以x_s表示，P0.05为差异有显著性意义。3、以小鼠红细胞测试：即体外溶血试验材料：家兔/小鼠、离心机

6、、水浴锅、试管、离心管、蒸馏水、生理盐水，供试材料。试验过程：取家兔1只自耳静脉采血(或心脏采血)10ml，置放有玻璃珠的三角瓶中，轻微搅拌去除纤维蛋白。将血移入有5-10ml生理盐水的离心管中，混匀后2500r/min离心5min，弃去上清液，如此方法用生理盐水反复洗3-4次至上清液呈无色透明为止。将洗涤好的红细胞用生理盐水配制成2%的红细胞悬液，备用。项目P试管号1相2相&牛供试药液(ml)，0.10.2中0.3p0牛0.5pq生理盐水(ml)心2.42.3p2.2p2.U202.5p4蒸谓水(ml屛相相相相252乐红细胞悬液(ml)2.5p2.5p2.5p252.5p2.5p25结果p表

7、1溶血试验设计注：+为溶血，一为丕溶血结果判断：全溶血：溶液澄明红色，管底无红细胞残留；部分溶血：溶液澄明或棕色，管底有少量红细胞残留；无溶血：红细胞全部下沉，上层液体无色澄明；凝集：不溶血，红细胞在试管底部凝集，振摇后细胞不能分散。4、以小鼠淋巴细胞(有核细胞)测试：取小鼠脾脏细胞根据功能和表面标志物分选出T/B淋巴细胞(cytotoxicCD8+Tcells、cytotoxicCD8+Tcells)invitro:样品材料与小鼠血样配制100mg/mL进行体外培养，培养方式基本同成纤维细胞，以流式细胞仪分选小鼠脾内淋巴细胞并计数。invivo:按10mg/kg给予小鼠血静脉注射样品溶液，以

8、流式细胞仪分选小鼠脾内淋巴细胞并计数5、动物实验测定炎性反应：样品如制成导管类(如导尿管、深静脉置管等)可以设计动物实验比较非抗菌材料和抗菌材料对机体产生的局部炎性反应程度，HE染色观察临近细胞形态、不同时间点血清IL-10和TNF-a的变化(反映炎症反应程度)。可用统计学的方法分析。1)兔肿瘤坏死因子Q定量检测：按试剂盒说明书操作，酶标仪读值，波长为450nm。2)白介素10(ILlO)定量检测：按试剂盒说明书操作，酶标仪读值，波长为450nm。抗菌性能测试：取金黄色葡萄球菌(ATCC6538)、大肠杆菌(8099)、(霉菌代表)白色念珠菌(ATCC10231)铜绿假单胞菌(ATCC1544

9、2)、伤寒沙门菌的斜面新鲜培养物，将菌液进行活菌计数，并用稀释液(含1%蛋白胨的0.03mol/LPBS(pH7.27.4)配制成含菌量均为5x10510 x106cfu/mL的菌悬液。基本材料抗菌性能测试：将样本分别放入无菌平皿中，加菌悬液50吐于各样本上记录各管加菌时间，分别于加菌后2,5,10,20,60min间隔时间，接种血平板，同时将样本放入5mL营养肉汤管内。将接种细菌的血平板及肉汤管放37T培养48h，观察初步结果，在无菌生长管继续培养至第7天。若肉汤管浑浊及血平板有菌生长，记为阳性，以(+)表示；如第7天仍澄清，视为无菌生长，以(-)表示。琼脂扩散法测抑菌圈：将试验菌种加入已灭

10、菌的培养皿中，细菌液浓度约为5x10510 x106cfu/mL/3x108CFU/mL,真菌约为5CFU/mL,然后将溶化后的琼脂培养基冷却至50C左右，以无菌手法倾注入培养皿中,每个内径9cm的平皿倾注15mL,混合均匀后，取直径10mm的滤纸片沾取抗菌剂溶液置于培养基平板上，细菌于37C恒温培养16h18h,真菌于28C恒温培养48h,观察并量取抑菌圈大小。抑菌圈大小按下式计算:W=T-D式中:W抑菌圈尺寸(mm);T抑菌圈(包括滤纸片)直径(mm);D滤纸片直径(mm)。结果判断：由于滤纸圆片所吸附的药液慢慢向四周扩散，因此在滤纸片的周围就出现清晰的抑菌圈(加入抑菌剂对供试菌有抑制效果

11、)。抑菌圈的大小代表药剂抗菌力的高低。在一定的药剂浓度范围内，药剂的浓度越高则抑菌圈的直径越大。此法同样适合于测定单个菌的抗菌效果。连续稀释法测定MIC:将抗菌剂原液稀释至200ug/mL,然后进行对倍稀释，直至0.39ug/mL,得到10个递减的浓度，将不同浓度的抗菌剂分别混入培养基中，按(2)的方法制成平板，然后将试验菌点种于平板上，直径9cm的培养皿各点种10株试验菌(细菌液浓度为104CFU/mL105CFU/mL,真菌约为5CFU6mL),同时进行无药平板对照，培养，并观察记录不同样品对不同菌种的最低抑菌浓度(MIC,ug/mL)。注：连续稀释法一般进行几何系列稀释，用恒定比例通常是

12、2倍，将液体从一试管转移到另一试管的稀释方法，由于误差是积累的，稀释小于4倍无意义。该方法可定量测定抗菌剂的最低抑菌浓度MIC。试管液体培养基稀释法是最为常用的。消毒技术规范.2002)中2.1.8.4采用此方法。吸光度法：若上清液中菌浓迅速降低并超出吸光度法的检测下限为此，可采用氯化三苯基四氮(TTC)显色法来考察抗菌材料的抗菌行为.TTC是一种小分子物质，可以通过细胞壁和细胞膜被活菌摄取，在脱氢酶作用下转化为红色的三苯基甲(TF),因此测定TTC的摄取量即可作为衡量细胞活性的一个重要指标.很据下式:抑茵率(%)对照繭揪吸光度含样品菌槪吸光度|2|-対照歯液吸光度*抗菌实效的测定？：同一样品

13、进行多次琼脂扩散法测抑菌圈，以测定样品的抑菌实效？注：不要混淆杀菌和抑菌的概念杀菌作用的评价和抑菌作用的评价是不同的抑菌作用评价包括(1)连续稀释法(2)扩散法杀菌作用是由于微生物和抗菌剂接触后，产生了一些不可逆的致死过程。杀细菌，真菌试验是使大量微生物与抗菌剂接触，培养不同时间后，测定活菌数，是一种定量方法。杀菌作用评价试验的终点定为全部杀死或无菌并不科学，杀死细菌百分数为99.9%定义为杀菌作用的终点更为合理。在GB159811995消毒与灭菌效果的评价方法与标准中是菌杀灭率99.9%作为消毒和灭菌效果的判定值。而GB15979.2002一次性使用卫生用品卫生标准，对一次性使用卫生用品杀菌

14、效果要求定为90%,主要是由于产品属非杀菌，消毒剂指标略有放宽。抗菌纤维的吸附动力学和吸附选择性：穿透曲线测定：调整E.Coli菌液浓度为A600=1.500，使该浓度菌液向上通过含有一定质量抗菌纤维的薄层柱。为了保证薄层柱填充的均匀性，一定质量的抗菌纤维在去离子水中充分溶胀，然后在特定模具内真空过滤，将滤饼填充到薄层柱中采用部分收集器收集泵驱动流出液。用空白体系测定装置柱前死体积为0.85柱体积，此参数用于吸附穿透曲线的数据校正。参考文献的实验结果：首先测定抗菌材料的吸附动力学，在100mL、菌浓为109CFU/mL的菌液中加入0.8g抗菌材料,5min内菌浓即可降低到102CFU/mL,即

15、降低7个数量级.30min后检测不到活菌.在所有的情形下，加入抗菌纤维后初期菌浓迅速下降，然后趋缓，这表明抗菌纤维的抗菌过程可能是由两个不同阶段组成的，前者可能是快速吸附阶段，而后者则可能是杀菌阶段.抗菌材料的抗菌过程观测采用扫描电镜对抗菌材料和其表面的菌体进行观察：分别采用静态和动态吸附法考察聚阳离子型表面接触抗菌材料对大肠杆菌的吸附性能，测定吸附在材料表面菌体TTC-脱氢酶(or其他表面标志物？)的活性和菌体呼吸活性以揭示材料的抗菌作用机理，并采用电镜观察抗菌纤维表面菌体形态随时间的变化.HeLZ丄iuY,YangD.YaowuShengwuJishu.2006;13(1):45-48何兰

16、珍，刘毅，杨丹壳聚糖-明胶海绵状伤口敷料的制备及性能研究J.药物生物技术,2006,13:45-48.DingY,ZhangWQ.ZhongguoYiyaoGongyeZazhi.200&39(7):517-519.丁晔,张文清壳聚糖复合海绵材料的制备及性能J.中国医药工业杂志,2008,39(7):517-519.ISO10993-5-2009.医疗器械生物学评价第5部分ISO10993.12-2009“医疗器械生物学评价标准第12部分问题：1、是否需要设计测定物理性能的实验？2、是否需要设计测定分子量、红外光谱分析的实验？3、样品的特性(固体、液体or凝胶)对实验设计的影响？是否可以选择？

17、上海市第九人民医院整形外科杨茜附:文献参考(1)抗菌实验所用试剂和培养基的配制如下:营养琼脂培养基蛋白胨20g牛肉膏3g氯化钠5g营养琼脂15g蒸馏水加至1000ml除琼脂外其它成分溶解于蒸馏水tfl,调整pH值至7.27.4,加入琼脂，加热溶解、分装，于12lC压力蒸汽灭菌20mill备用。营养肉汤培养基蛋白胨20g牛肉啻3g氯化钠5g蒸馏水加至1000ml将各成分溶解于蒸馏水，调整pH值至7.27.4,分装，于12lC压力蒸汽灭菌20min备用菌悬液的制备用接种环将第四代大肠杆菌(ArllCC8739)菌种以划线法接种到营养琼脂平皿上，在37C的恒温培养箱中培养24h,取平皿上典型的菌落移种到盛有营养肉汤培养基的三角烧瓶中，在37C的恒温培养箱中培养24h，用营养肉汤培养基进行10倍稀释，制成(15)X103/ml量级的菌液待用。抗菌性能的测试步骤如下：将培养皿、试管及移液管等在高压水蒸气的条件下灭菌消毒，并将固体状的营养琼脂加热至液体状。将适量的液态琼脂加到两个培养皿中，使其将培养皿底部全部覆盖，冷却待用。使用经灭菌处理的药棉将菌液(5X103/m1)均匀涂在培养皿中的营养琼脂上，室温条件下干燥5min。取改性前的天然乳胶一小块(阴性对照试样)、改性